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8種常見核酸提取方法,讓科研更輕松

瀏覽次數(shù):30428 發(fā)布日期:2021-10-19  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

核酸作為一切分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ),其提取通常是開啟生物學(xué)研究的第一步,而且提取的核酸質(zhì)量高低也是決定下游實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素之一。無論后續(xù)的克隆、PCR、QPCR、建庫測序等等都需要核酸才能順利進(jìn)行。今天我們就來簡單了解核酸提取的基本原理和方法。


什么是核酸?

核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA主要集中在細(xì)胞核內(nèi),線粒體和葉綠體中,而RNA主要分布在細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。

核酸作為基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ),是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象。無論是進(jìn)行核酸的結(jié)構(gòu)還是功能研究,首先都需要對(duì)核酸進(jìn)行提取和純化。核酸提取為大量廣泛研究和應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

 

核酸提取的基本步驟

1、裂解細(xì)胞,釋放核酸。使用裂解液破壞樣品細(xì)胞結(jié)構(gòu),從而使樣品中的DNA游離在裂解體系中;
2、核酸的分離與純化。需要將與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子和其他不需要的核酸分子去除;

3、核酸的濃縮、沉淀;
4、純化核酸。純化則是使DNA與裂解體系中的其它成分,如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。

 

核酸提取純化原則和要求

1、需要保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性,為下游實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備;
2、排除其它核酸分子的污染(提取DNA時(shí)排除RNA的干擾,反之亦然);

3、核酸樣品中沒有對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和高濃度的金屬離子;
4、將核酸樣品中其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染降到最低程度。
 

核酸提取純化的常見方法

(一)核酸提取按照提取方式可分為手工提取通量較高的自動(dòng)化提取。
(二)按照提取原理有如下方法:

1. 煮沸裂解法:此法一般用于DNA的手工提取。染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大很多,且染色體DNA為線狀分子,而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)裝分子;當(dāng)加熱處理DNA溶液時(shí),線狀染色體DNA容易發(fā)生變性,共價(jià)閉合的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象;變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀,而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中,從而可通過離心將兩者分開。煮沸裂解法提取DNA,得量少,雜質(zhì)多,DNA可能會(huì)出現(xiàn)斷裂,主要適用于一些粗略的實(shí)驗(yàn)。

2. 酚氯仿抽法:此法是DNA提取的經(jīng)典方法,主要是使用兩種不同的有機(jī)溶劑交替抽提將蛋白去除。用苯酚處理勻漿液時(shí),由于蛋白與DNA的聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶,同時(shí)苯酚抑制了DNase的降解作用,蛋白質(zhì)分子溶于酚相,而DNA溶于水相。離心分層后取出水層,多次重復(fù)操作,再合并含DNA 的水相,利用核酸不溶于醇的性質(zhì),用乙醇沉淀DNA。離心后,DNA可取出。酚氯仿抽提最大的優(yōu)勢是成本低,對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較低。提取的DNA保持天然狀態(tài)。獲得的DNA純度高、片段大、效果好,缺點(diǎn)是操作較為繁瑣。

3. 濃鹽法:高鹽沉淀法是酚氯仿抽提方法的一個(gè)變種,利用RNP和DNP在電解溶液中溶解度不同,將二者分離。優(yōu)點(diǎn)事省略了酚氯仿抽提操作的麻煩,并且?guī)缀蹩朔朔勇确鲁樘岱椒ǖ囊磺腥秉c(diǎn),只是得到DNA的純度不夠穩(wěn)定。

4. 陰離子去污劑法:用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中提取DNA。由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,同時(shí)陰離子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA。SDS法操作簡單、溫和,也可提取到較高分子量 DNA ,但所得產(chǎn)物含糖類雜質(zhì)較多。

5. 異硫氰酸胍/苯酚法(Trizol法):Trizol法是提取RNA的經(jīng)典方法,在勻質(zhì)化或溶解樣品中,Trizol試劑可保持RNA的完整性,同時(shí)又能破壞細(xì)胞及溶解細(xì)胞成分。加入氯仿離心后,裂解液分層成水相和有機(jī)相。RNA存在于水相中。水相轉(zhuǎn)移后,RNA通過異丙醇沉淀回收。移去水相后,用乙醇可從中間相沉淀得到DNA,加入異丙醇沉淀可從有機(jī)相得到蛋白質(zhì)。Trizol法適用于普通的植物組織、動(dòng)物組織以及真菌和細(xì)菌等的RNA提取實(shí)驗(yàn)。
 
5. CTAB法原理(植物DNA提取經(jīng)典方法)
CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化銨),是一種陽離子去污劑,具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物,只是不能沉淀核酸。通過有機(jī)溶劑抽提,去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。


6. 離心柱純化:通過特殊硅基質(zhì)吸附材料,能夠特定吸附DNA,而RNA和蛋白質(zhì)順利通過,然后利用高鹽低PH結(jié)合核酸,低鹽高PH值洗脫,來分離純化核酸。離心柱純化也是試劑盒提取中廣泛的使用方法。離心柱法DNA提取試劑盒價(jià)格較低,操作相對(duì)簡單,在市面上應(yīng)用較為廣泛。但是其具有樣本需求量大,損失多,對(duì)于珍稀樣本無能為力,同時(shí)不便于高通量、自動(dòng)化操作等劣勢。

7. 磁珠法提取:磁珠法利用了磁性顆;钚曰鶊F(tuán)在一定條件下可與核酸結(jié)合和解離的原理,先使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,帶有活性基團(tuán)的磁性顆粒可特異性吸附從細(xì)胞中游離出來的核酸分子,而樣品中的其他干擾物則很好的移除了,在磁場作用下,磁性顆粒與液體分開完成,最后回收顆粒(即磁珠-DNA 混合物),再用洗脫液洗脫即可得到純凈的DNA,獲得質(zhì)量較高的核酸模板。磁珠法不需要離心、無需加入多種試劑,操作簡單,符合核酸自動(dòng)化提取要求。但是成本較高,科研端使用很難普及。

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