深藍(lán)云數(shù)字PCR技巧之Drop-off方法檢測(cè)基因缺失

數(shù)字 PCR (dPCR)可以提供比傳統(tǒng)qPCR更高的精準(zhǔn)度和靈敏度，尤其是在腫瘤學(xué)應(yīng)用中，dPCR能精準(zhǔn)且可靠地檢測(cè)到較低濃度樣本中的稀有突變等。

目前，使用Drop-off方法可以同時(shí)檢測(cè)基因組內(nèi)發(fā)生的多個(gè)序列插入、缺失或堿基突變，最大限度地提高單個(gè)檢測(cè)中樣本的數(shù)據(jù)輸出，節(jié)省時(shí)間和檢測(cè)成本。本文以naica®微滴芯片數(shù)字PCR平臺(tái)為基礎(chǔ)，對(duì)使用Drop-off方法檢測(cè)基因缺失進(jìn)行闡述。

首先，為大家介紹一下Drop-off方法原理：

☑ Drop-off是指利用探針在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)基因組序列的同源基因突變（包括核苷酸的缺失，插入和替換）。

☑ Drop-off方法包括兩個(gè)TaqMan 探針：一個(gè)與野生型序列互補(bǔ)而與突變位點(diǎn)不發(fā)生互補(bǔ)的Drop-off探針和一個(gè)與突變型和野生型基因都互補(bǔ)的Reference探針（如下圖A）。

☑ 當(dāng)野生型等位基因存在時(shí)，Drop-off探針和Reference探針都將與目標(biāo)序列雜交，產(chǎn)生雙重陽性信號(hào)（如下圖B，藍(lán)色群）。相反，如果存在突變的等位基因，即使一個(gè)核苷酸的突變也會(huì)阻止Drop-off探針與之雜交，因此只有Reference探針與目標(biāo)基因結(jié)合，從而得到一個(gè)陽性信號(hào)（如下圖B，綠色群）。

A.Drop-off和Reference探針及引物在目標(biāo)基因上的示意圖（FP：上游引物，RP：下游引物）

B. Crystal Miner 2D圖中顯示來自雙陽性野生型等位基因的熒光簇（天藍(lán)色：藍(lán)色和綠色）和突變等位基因的熒光簇（綠色）及陰性微滴簇（黑色）。Drop-Off探針僅和野生型序列互補(bǔ)，而跳過突變序列（圖B，縱坐標(biāo)的藍(lán)色通道）；Reference探針與突變和野生型等位基因進(jìn)行互補(bǔ)（圖B中橫坐標(biāo)的綠色通道）。

野生型濃度CWT可以直接從雙陽性微滴中PWT的比例得出。但是，Drop-off突變體濃度Cmut必須從確信包含突變等位基因的微滴比例Pmut中得出。

由于野生型和突變等位基因可能被分配到同一個(gè)微滴里面，因此采用雙陽性微滴對(duì)突變體進(jìn)行定量是不準(zhǔn)確的，只能通過排除雙陽性微滴來確定Pmut（將突變陽性群體定義為對(duì)Reference探針呈陽性但對(duì)Drop-off探針呈陰性的微滴）。

上文已對(duì)檢測(cè)原理和檢測(cè)方法進(jìn)行了闡述，那么如何對(duì)Drop-off檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析呢？

1、使用高靈敏naica®微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)的藍(lán)色和綠色兩個(gè)通道對(duì)突變等位基因（MAF）進(jìn)行絕對(duì)定量。

2、使用Crystal Miner分析軟件進(jìn)行量化分析計(jì)算。

A 、通過自主圈群功能選中三種微滴群體并進(jìn)行命名-突變型陽性（綠色），雙陰性（黑色），野生型雙陽性（天藍(lán)色：藍(lán)色和綠色）。

B、通過naica Crystal Miner軟件獲得Drop-off突變型的濃度Cmut（綠色），以及野生型濃度CWT（天藍(lán)色）。

C、計(jì)算MAF Drop-off突變，即MAF Drop-off=Cmut/（Cwt+Cmut）。（如想了解關(guān)于Cmut和Cwt詳細(xì)計(jì)算方法，可點(diǎn)擊鏈接：

https://www.gene-pi.com/tutorial/drop-off-assay/）

小提示：

如果不排除雙陽性的微滴并將其歸為陰性微滴中， Drop-off突變體的MAF則會(huì)被低估，對(duì)于任何Cmut＜100cp/µL，這一系數(shù)幾乎是恒定的（例如在樣品中CWT為500 cp/µL時(shí)，低估了25%）。保留雙陽性微滴既不會(huì)降低測(cè)得的Drop-off突變體濃度的相對(duì)不確定性，也不會(huì)降低LOD。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

☑ 通過使用naica Crystal Miner圈群功能，可以對(duì)Drop-off突變進(jìn)行精準(zhǔn)定量。

☑ 排除模棱兩可的微滴，在不降低測(cè)量精度的前提下避免了低估Drop-off突變體的濃度。

☑ 本次檢測(cè)使用了naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的藍(lán)綠兩個(gè)通道，第三個(gè)檢測(cè)通道還可以添加一個(gè)內(nèi)部對(duì)照或同時(shí)量化一個(gè)MAF點(diǎn)突變。

如想學(xué)習(xí)更多Drop-off知識(shí)，可以通過以下方式獲取Drop-off計(jì)算方法：

http://www.cycloudbio.com/product/36748.html

naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司的naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)在進(jìn)行核酸檢測(cè)時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。該系統(tǒng)利用cutting-edge微流體創(chuàng)新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作為數(shù)字PCR過程的耗材。樣品通過毛細(xì)通道網(wǎng)格以30,000個(gè)微滴的形式進(jìn)入2D芯片中。3色熒光檢測(cè)儀器，整個(gè)流程只需要2.5小時(shí)，并可進(jìn)行數(shù)據(jù)的質(zhì)控和結(jié)果追溯分析，獲得的數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測(cè)，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)濃度。