LI-6800測量新技術(shù)-- 做整條A-Ci曲線，只需要4min

苑玲玲

苑玲玲，博士，2014年畢業(yè)于University of Nebraska-Lincoln，專業(yè)為Plant Breeding and Genetics。同年，加入LI-COR公司環(huán)境部，現(xiàn)為資深應(yīng)用科學(xué)家。

你用400 ppm min^-1來Ramp，就意味著做整條A-Ci曲線（例如從10ppm-1600ppm），只需要4min，這就大大縮短了測量時間【考慮到種內(nèi)和種間差異，具體Ramp參數(shù)設(shè)置，請通過預(yù)實驗確定】。新技術(shù)顯著縮短了測量耗時，極大提升了測量效率。

新技術(shù)和傳統(tǒng)方法得到的Vcmax、Jmax和二氧化碳補償點吻合度高。但是，傳統(tǒng)方法測量得到的原始數(shù)據(jù)點少，曲線擬合出來的參數(shù)具有更大的不確定性。除了A-Ci曲線，這項新技術(shù)也在調(diào)查類測量（Survey Measurement）和光響應(yīng)曲線測量（A-Q Curve）方面做了驗證。 

LI-COR 苑玲玲：LI-6800測量新技術(shù)DAT.mp3

A new technique for gas exchange measurements: Dynamic Assimilation^TM

2021.10.16 武漢

各位老師同學(xué)，大家好！今天給大家介紹一項用于葉片氣體交換測量的新技術(shù)。

叫做Dynamic Assimilation^TM，或者是叫Dynamic Assimilation^TM Technique。首字母的縮寫就是DAT（動態(tài)吸收測量技術(shù)）。

首先我們簡要回顧一下氣體交換測量的歷史，之后我會給大家介紹目前所使用的測量技術(shù)，然后我會重點談一下DAT。

世界人口的急劇增長使得人們對于糧食和能源的要求不斷增大，這就刺激了光合作用的研究。而對于光合作用研究的需求，又推動了相關(guān)儀器和測量技術(shù)的發(fā)展。

回顧歷史，100年前，大約是在1920年左右的時候，研究人員通過化學(xué)試劑滴定的方法來測量葉片對于CO₂的吸收，作為評估葉片光合能力的指標。核心原理就是利用CO₂與氫氧化鋇產(chǎn)生碳酸鋇沉淀，然后用酸來滴定中和，通過對比空白組所需酸的量的差別來計算葉片對于CO₂的吸收。

人工搭建的這個設(shè)備，大家可以看到這張圖，操作起來費時費力，這張圖顯示了當時所用的設(shè)備。圖片出自下面這篇paper，引用過來的。這張圖顯示的就是通過這種滴定方法測得的一天中甘蔗葉片對于CO₂吸收的日變化。

到了上個世紀四五十年代，紅外線氣體分析儀逐漸發(fā)展了起來，人們便開始把這個紅外線氣體分析儀用在光合測量設(shè)備里面。

當時很多設(shè)備因為體積龐大、操作繁瑣，基本只能在室內(nèi)使用。但是因為大家對戶外測量是很有需求的，所以一些可移動的設(shè)備也被研發(fā)出來，如像這個Slide右手邊這種。

到了上個世紀八十年代、九十年代的時候，LI-COR公司研發(fā)的LI-6200、LI-6400相繼問世，可以說是拎起來就走，之后更先進的LI-6800問世，那就更方便了，操作直觀，自動化控制。

回顧歷史，我們可以看到，人們對于光合測量設(shè)備的不斷追求，為光合研究提供了新工具。

現(xiàn)在市面上的氣體交換測量系統(tǒng)，一般都是采用開路式的方法、開放式氣路（進行測量）。

所謂開放式氣路，顧名思義是指非封閉。氣流持續(xù)的有進有出。對LI-6800來說，外界的空氣進入主機，水汽、CO₂濃度被調(diào)適以后，出來，進入分析器。分流，一路不接觸葉片直接被測量，叫做Reference，作為對照。另外一路經(jīng)過葉片，然后被測量，叫做Sample，最后氣流排到外界。Anyway，就是說氣流有進有出，這是一個開放式氣路。那么在葉片所在的這個位置，就是葉室這個地方，具體發(fā)生了什么呢？

這個長方形代表整個葉室部分，氣流流經(jīng)葉室，進氣流速為u1，進氣流中CO₂濃度為c1,水汽濃度為w1，出葉室的CO₂濃度_c2，水汽濃度_w2，這些指標都會被儀器直接測量記錄。由于葉片的光合作用吸收CO₂，蒸騰作用釋放水汽，這就是所謂的氣體交換，使得_c1和_c2之間，_w1和_w2之間存在差值，這個差值用于計算CO₂同化速率和蒸騰速率。

在這個公式里，A代表CO₂同化速率，E代表蒸騰速率，s代表葉面積。基于對這個氣流水汽和CO₂濃度的測量，蒸騰速率和CO₂同化速率就用這兩個公式計算出來。這里需要注意的一點是，這兩個公式是基于“Steady State”，或者說是穩(wěn)定狀態(tài)。長久以來，開路式氣體交換測量，都是依賴于“Steady State”。

那你可能要問了，什么叫“Steady State”呢？它是指葉室情況穩(wěn)定，達到一個穩(wěn)定狀態(tài)，就是說CO₂，_c1和_c2達到一個恒定值，水汽w1和w2達到一個恒定值，氣流_u1和_u2也要達到一個恒定狀態(tài)。

一旦不穩(wěn)定，用這個公式計算出來的CO₂同化速率就是不對的了。比如說，當葉室是空的、關(guān)閉的，沒有葉片的時候，測得的CO₂的同化速率應(yīng)該是零，對吧。因為沒有葉片，不管你的CO₂濃度控制是多少，或者怎樣變化，光合值應(yīng)該都為零，但是市面上光合儀的表現(xiàn)，卻不是這樣。

大家會經(jīng)常注意到，如果你改變CO₂濃度，比如像左邊這張圖，CO₂控制從400ppm到600ppm，您能看到光合值突然有很大的波動，然后再逐漸的回歸到零。

這就意味著，在記錄數(shù)據(jù)的時候，你需要等待，需要等待葉室又重新達到一個新的Steady State后，才能記錄數(shù)據(jù)。大家能看到，這兩張圖中，前30秒的階段是一個Steady state，大概70s以后，也是一個Steady state，從30s到70s之間，是一個Non-steady state，就是一個非穩(wěn)定狀態(tài)。

如果您在Non-steady state階段記錄數(shù)據(jù)，那您的數(shù)據(jù)就是不對的。

那有沒有一個方法可以實現(xiàn)更快的氣體交換測量呢？

幾年前，LI-COR聯(lián)合The University of New Mexico的研究人員，推出了一項新技術(shù)叫做RACiR^TM，RACiR^TM用于CO₂響應(yīng)曲線的測量。它是通過Ramp CO₂濃度（連續(xù)降低或升高CO₂的濃度），像左邊這張圖，之后通過空葉室校正來得到最終的數(shù)據(jù)。RACiR^TM讓使用者可以更快的測量A-Ci曲線，進而得到Vcmax等參數(shù)，這讓快速篩選成為可能。

另外由于CO₂是連續(xù)變化的，儀器在連續(xù)的快速記錄數(shù)據(jù)，因此能獲得大量的數(shù)據(jù)點。大量的數(shù)據(jù)點，對于A-Ci曲線的擬合是大有幫助的。但RACiR^TM是有局限性的，只能用于A-Ci曲線的測量，不能用于其他類型的測量，如調(diào)查式測量（Survey Measurement）或光響應(yīng)曲線的測量（A-Q Curve）。

另外RACiR^TM所用的這個CO₂ Ramp Rate，不能太快，局限于100ppm/min。另外RACiR^TM需要空葉室校正過程。測量數(shù)據(jù)的準確性，依賴于空葉室校正的數(shù)據(jù)準確性。

那有沒有一項技術(shù)，可以突破RACiR^TM的這種局限呢？比如說CO₂ Ramp rate能不能更快一些? 除了A-Ci曲線的測量，可不可以應(yīng)用到其他類型的測量上呢？

下面我就用一些Slides，來講一講由LI-COR研發(fā)并成功應(yīng)用到LI-6800的這項新技術(shù)。

其實對于開放式測量系統(tǒng)，它的Fundamental質(zhì)量平衡公式是這個，相比之前的Slide，這個公式里多了一項，就是這個dc/dt。這個公式很好理解，這個_u1c1，代表了有多少CO₂進入了葉室，_u2c2是多少CO₂離開了葉室，SA這一項是多少CO₂被吸收，這個dc/dt就是葉室內(nèi)的CO₂濃度隨時間的變化。

在Steady State的情況下，dc/dt為零。就是說葉室內(nèi)的CO₂濃度隨時間是不變的。當dc/dt=0時，通過推導(dǎo)，你能看到這個A值，就是在Steady State下使用的公式。

所以，Steady State下使用的公式是Fundamental質(zhì)量平衡方程的一種特殊狀態(tài)，即dc/dt=0。

那么不在Steady State的情況下，或者說dc/dt不等于0的情況下，這個等式就是一個Dynamic質(zhì)量平衡方程。在這種情況下，你把A值推導(dǎo)出來，就是右邊這個公式。這個公式可以說是Dynamic Assimilation^TM Technique（動態(tài)吸收測量技術(shù)）的核心公式。

因為LI-6800的獨特性，比如說，快速精準連續(xù)的環(huán)境條件控制、葉室緊靠分析儀，以及Range Match功能，使得Dynamic Assimilation^TM Technique（動態(tài)吸收測量技術(shù)）這項新技術(shù)可以整合進LI-6800系統(tǒng)。這項新技術(shù)已經(jīng)申請了專利保護。

經(jīng)驗證，這項新技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)的Steady State的測量方法以及RACiR^TM。

我們做空葉室實驗，就是用關(guān)閉的空葉室，CO₂的同化速率A應(yīng)該為零。當CO₂濃度改變后，比如CO₂濃度從400ppm提升到600ppm，基于Steady State的技術(shù)測量的數(shù)據(jù)點是右圖中紅色的Curve，能看到，CO₂同化速率A會有一個大的波動，等待一段時間（約40s）后，才會重新回到零。

基于這項新技術(shù)，CO₂同化速率A，也就是這個藍色的Curve，只有一個小小的波動，并且很快（約5s）就回到了零。這意味著，在測量葉片的時候，等待的時間會大幅減少。

這張Slide，同樣是空葉室實驗，沒有葉片，CO₂濃度從0ppm改變到1600ppm，連續(xù)變化的整個過程中，大家看到，這個藍色的Curve，是使用新技術(shù)Dynamic Assimilation^TM Technique（動態(tài)吸收測量技術(shù)）測量得到的凈光合速率A，整個過程一直保持在0附近。但是傳統(tǒng)的測量方法，A值會有很長一段時間（約500s）的升高，當CO₂穩(wěn)定以后，傳統(tǒng)測量方法得到的A值才會重新回到0。 

除了在空葉室的驗證，以下這些Slides通過真實的測量葉片來驗證這項新技術(shù)的優(yōu)勢。

下面左邊這張圖比對了三種不同的方法，做的A-Ci響應(yīng)曲線，其中，藍色、紅色代表是Dynamic Assimilation^TM Technique（動態(tài)吸收測量技術(shù)），黃色代表的是RACiR^TM，紫色的方塊和紅色的×是傳統(tǒng)方法所測量的A-Ci響應(yīng)曲線。大家能看到這些結(jié)果是基本吻合的，DAT #1和#2有什么區(qū)別呢？CO₂ Ramp速率是不一樣的，#1是200ppm/min, #2是400ppm/min。實驗樣品是向日葵葉片。大家可以看到，對于向日葵葉片來說，兩個Ramp速率，結(jié)果差別很小。

你用400ppm/min來Ramp，就意味著做整條A-Ci曲線（10ppm-1600ppm），只需要4min，這就大大縮短了測量時間。傳統(tǒng)測量方法，一條A-Ci響應(yīng)曲線需要~30min。右邊這張圖就是Curve起始階段放大后的圖，大家可以看到，新技術(shù)和傳統(tǒng)方法得到Vcmax、Jmax和二氧化碳補償點是基本吻合的。但是，傳統(tǒng)方法測量得到的數(shù)據(jù)點少，曲線出來的參數(shù)具有更高的不確定性。那除了A-Ci曲線，這項新技術(shù)也在調(diào)查類測量方面做了驗證，并且有明顯的優(yōu)勢。

下面這個實驗是調(diào)查式測量，一開始這個葉室為關(guān)閉狀態(tài)，空葉室CO₂R和CO₂S都是穩(wěn)定的，起始階段CO₂同化速率A也是穩(wěn)定的。然后在這個時間點，葉室被打開，打開以后夾上葉片，關(guān)閉葉室，葉片之前做過光適應(yīng)，藍線是用新技術(shù)測量得到的CO₂同化速率，紅色是傳統(tǒng)方法測量得到的CO₂同化速率，可以明顯的看到，這個新技術(shù)回到穩(wěn)定狀態(tài)更快。最右邊這張圖就是畫圈部分的放大圖，傳統(tǒng)方法滯后約20-30s。

另外，這項新技術(shù)也能用于光響應(yīng)曲線（A-Q Curve）的測量。由于植物響應(yīng)光強變化要慢于CO₂的變化，使用這項新技術(shù)做光響應(yīng)曲線測量時，光強的Ramp rate不能太快，因此完成光響應(yīng)曲線所需要的時間與傳統(tǒng)的常規(guī)方法是接近的。新技術(shù)的優(yōu)點是數(shù)據(jù)點多，有助于更準確的曲線擬合。

總結(jié)一下，Dynamic Assimilation^TM（動態(tài)吸收測量技術(shù)）在三種重要的測量類型中，都可以應(yīng)用，尤其是在A-Ci曲線測量和調(diào)查類測量中，新技術(shù)顯著提高了測量速度，密集的數(shù)據(jù)點有助于曲線擬合；在光響應(yīng)曲線（A-Q Curve）的測量中，優(yōu)勢體現(xiàn)在密集的數(shù)據(jù)采樣上。 

這項新技術(shù)是由LI-COR的兩位科學(xué)家Aaron J Saathoff和Jon Welles共同開發(fā)，并成功整合應(yīng)用到了LI-6800里面。關(guān)于這項新技術(shù)的文章，兩個月前發(fā)表在Plant Cell& Environment雜志上，題目是Gas exchange measurements in the unsteady state（doi.org/10.1111/pce.14178）。這篇文章是Open Access的，大家感興趣的可以找來讀一下。好，今天我的報告就到這里，謝謝大家。

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