針對新手專用PCR原理講解與分析

什么是實時熒光定量PCR（qPCR）?

在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過Cq值和標準曲線對起始模板進行定量分析的方法。
 

一．使DNA產物發(fā)出熒光的常用標記方法

① 非特異性熒光染料—SYBR Green

熒光染料也稱DNA結合染料，SYBR Green 是一種結合于所有DNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。游離的SYBR Green幾乎沒有熒光信號，但結合雙鏈DNA后，其熒光信號可呈數(shù)百倍的增加。隨PCR產物的增加，PCR產物與染料的結合量也增大，其熒光信號強度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。
 

▲ 圖1. SYBR Green染料法發(fā)光原理
 

② 特異性熒光探針—TaqMan探針

qPCR中最常用的熒光探針為TaqMan探針，其基本原理是依據目的基因設計合成一個能夠與之特異性雜交的探針，該探針的5'端標記熒光基團，3'端標記淬滅基團。完整的探針，兩個基團的空間距離很近，淬滅基團的靠近會通過空間上的熒光共振能力轉移（FRET）而顯著降低由熒光基團發(fā)射的熒光。

PCR擴增時，探針一般先于引物結合到目的基因序列上，結合位點位于其中一個引物結合位點的下游。隨著引物的延伸通過Taq DNA聚合酶的5'外切酶活性，探針發(fā)生水解，熒光基團和淬滅基團進行分離，從而增強了熒光基團的信號。每經過一個PCR循環(huán)，就會有更多的熒光基因從探針上脫離，熒光強度會隨著PCR產物的增加而增加。因此，根據PCR反應體系中的熒光強度即可得出初始DNA模板的數(shù)量。
 

▲ 圖2. TaqMan探針法發(fā)光原理
 

二．熒光定量PCR系統(tǒng)如何記錄熒光信號

所有的實時熒光定量PCR系統(tǒng)都有三個共同的組成部分：溫控系統(tǒng)，光源系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。溫控系統(tǒng)用于PCR擴增，執(zhí)行高溫變性，低溫退火和中溫延伸的步驟；光源系統(tǒng)用于激發(fā)熒光染料或熒光基團，使其發(fā)出信號；檢測系統(tǒng)采集熒光信號。溫控系統(tǒng)每完成一個循環(huán)，光源和檢測系統(tǒng)則先后進行激發(fā)和采集，從而實時記錄每一個循環(huán)熒光信號的變化。隨著PCR反應的進行，產物逐漸積累，熒光信號逐漸增強。

▲ 圖3. 實時熒光定量PCR系統(tǒng)檢測原理
 

那么Azure Cielo™ 實時熒光定量PCR系統(tǒng)，采用了高能LED作為光源系統(tǒng)，可保證光源強度高，光源一致性好；高品質的帕爾貼溫度模塊作為溫控系統(tǒng)，升降溫速率快，可設置12列跨度30°C的溫度梯度；卓越的CMOS拍照+光纖信號傳輸作為檢測系統(tǒng)，CMOS檢測靈敏度高，光纖傳輸速度快，無光損失和噪音干擾，無需ROX校準。
 

Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)的高配置保證為您的科學研究提供高精準度、高靈敏度和高可靠性的實驗結果。

▲ 圖4. Azure Cielo™ 實時熒光定量PCR系統(tǒng)
 

三．如何根據熒光信號得出初始模板量

實時熒光定量PCR系統(tǒng)所監(jiān)測到的所有循環(huán)的熒光信號可以繪制成一條曲線，即為熒光擴增曲線。擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)期、線性期和平臺期。指數(shù)期內，每個循環(huán)PCR產物量大約增加1倍（假定100%反應效率），該階段的擴增反應具有高度特異性和精確度，所以重復性好。
 

▲ 圖5. 擴增曲線
 

qPCR軟件會在指數(shù)期劃定一個閾值線，閾值線對應一個熒光強度值，即閾值。在qPCR過程中，各擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時，所經過的擴增循環(huán)數(shù)即是Cq值。Cq值與初始模板量的對數(shù)成線性關系。樣本初始模板量越多，熒光信號達到閾值所經歷的循環(huán)數(shù)越少，即Cq值越小。
 

▲ 圖6. Cq值與初始模板量的關系