寬場顯微鏡佳良配置-景深擴(kuò)展與反卷積的詳解
雙十一剛過，肯定有不少小伙伴剁手了吧。雙十一不只是電商的購物狂歡節(jié)，還是令人心痛的單身日。小編作為單身狗著實(shí)羨慕那甜美的愛情。所以我只能化悲憤為力量全身心的投入到工作中去。作為儀器工作者本以為顯微鏡就是我最好的伙伴，后來發(fā)現(xiàn)我還是太年輕了，在這個(gè)講究CP感的時(shí)代里，我著實(shí)被寬場顯微鏡里最甜的CP秀了滿滿一臉。
作為報(bào)復(fù)的手段，我要把他們的故事講給大家聽，寬場顯微鏡最甜CP-景深擴(kuò)展與反卷積，接下來我就好好扒一扒它們的前世今生。
首先有請我們的男主角閃亮登場。景深擴(kuò)展又稱Z-Stacking，在說他的故事前，我們需要明白什么是景深。當(dāng)鏡頭對著處于焦面物體拍攝時(shí)，被拍攝物體與其前后的景物有一段清晰的范圍，這個(gè)范圍我們將其稱為“景深”。為了讓大家更好的理解，我在這里給大家舉個(gè)例子。
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就像圖中一樣，我們在觀察與拍照過程中，有時(shí)僅可以看清楚花瓣，有時(shí)花瓣根莖葉都可以看清楚，這就是因?yàn)榫吧畲笮〔煌�，大景深看清的物體多如左圖，小景深看清的物體少如右圖，那為什會(huì)產(chǎn)生這樣的區(qū)別呢？
一個(gè)鏡頭只有一個(gè)焦平面。處于焦平面上的物體經(jīng)過物鏡會(huì)在目鏡或相機(jī)芯片上形成一個(gè)點(diǎn)，非焦平面上的點(diǎn)會(huì)形成一個(gè)模糊圓，這個(gè)圓術(shù)語叫做彌散圓（circle of confusion），怎么去理解這段話呢？
如圖所示，黑色線條為焦平面，焦平面上的點(diǎn)經(jīng)過物鏡，在相機(jī)芯片或視網(wǎng)膜上形成一個(gè)小圓點(diǎn)，兩條綠色的線分別是非焦平面，非焦平面點(diǎn)經(jīng)過目鏡會(huì)形成一個(gè)圓圈，這個(gè)圓圈就是彌散圓（circle of confusion）。如果我們遠(yuǎn)離這張圖片，那會(huì)發(fā)生什么呢？我們中間的這個(gè)小點(diǎn)就看不到了，上下的兩個(gè)圓斑會(huì)越來越小，一直小到和這個(gè)點(diǎn)一樣大的時(shí)候，我們這時(shí)候就認(rèn)為它不是斑，而是點(diǎn)了。如果彌散圓小到人眼或芯片無法鑒別看起來就是一個(gè)點(diǎn)，那這個(gè)彌散圓稱為容許彌散圓，可產(chǎn)生容許彌散圓的平面之間的距離稱為景深。
我們再簡單一點(diǎn)，顯微鏡的景深就是當(dāng)前鏡頭，可以看清楚樣品的厚度。對于觀察者來說，同視野下能看清楚樣品的厚度越厚越好，越厚就證明鏡頭的景深越大。在顯微觀察中是否可以無限制追求大景深呢？答案是否定的。因?yàn)榫吧钆c物鏡的NA值負(fù)相關(guān)，而NA值與物鏡的分辨率及放大倍數(shù)正相關(guān)。關(guān)系如下圖所示：
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如何在高倍鏡下獲得大景深的圖像呢？這就輪到我們的男主出場了—景深擴(kuò)展。
在寬場顯微鏡中，增大顯微圖像景深的通常做法是對樣品進(jìn)行不同厚度位置的掃描，并采集程序列圖像，以一定的規(guī)則進(jìn)行融合，通過計(jì)算重建一幅大景深圖像。
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目前顯微鏡實(shí)現(xiàn)景深擴(kuò)展的基礎(chǔ)是什么？
硬件基礎(chǔ)：顯微鏡景深擴(kuò)展分為手動(dòng)景深擴(kuò)展與自動(dòng)景深擴(kuò)展。對應(yīng)的硬件基礎(chǔ)分別為手動(dòng)準(zhǔn)焦螺旋（手動(dòng)Z軸）與電動(dòng)準(zhǔn)焦螺旋（電動(dòng)Z軸）。
軟件基礎(chǔ)：Z軸控制與圖像處理。
如果想把我們男主角的魅力發(fā)揮到極致，電動(dòng)Z軸必不可少。因?yàn)榕c手動(dòng)景深擴(kuò)展相比電動(dòng)的優(yōu)勢有：1、一致性更高 2、步進(jìn)精度更高 3、可重復(fù)性更好 4、操作更為簡便。
從上文的介紹中大家明白了景深擴(kuò)展優(yōu)化了顯微鏡在豎直方向的成像效果，那與他在一起的反卷積的功能也就呼之欲出了：優(yōu)化寬場顯微鏡水平方向的成像效果。
接下來有請我們的女主角登場，同樣的，在講她的故事之前，我們要明白寬場顯微鏡存在分辨率的極限。
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從分辨率的公式中可以看出分辨率與NA值正相關(guān)。還記得上文中提到的景深與其負(fù)相關(guān)嗎？所以說從家庭背景的角度上景深擴(kuò)展與反卷積就開始彼此糾纏了。書歸正文，通過分辨率公式我們可以得出分辨率的極限是200nm，為了紀(jì)念公式的提出者—德國的光學(xué)物理學(xué)家恩斯特阿貝，人們把這個(gè)極限值稱為阿貝極限。人們?yōu)榱送黄品直媛蕵O限誕生了以共聚焦顯微鏡為代表的超高分辨率顯微鏡。它們通過改變照明結(jié)構(gòu)來突破寬場顯微鏡的分辨率極限，以獲取更加清晰的觀察結(jié)果。
今天我們討論的是寬場顯微中的最甜CP，共聚焦顯微鏡改變了光路結(jié)構(gòu)不在今天的討論范圍內(nèi)。那除了硬件改變來提高分辨率，可不可以不改變寬場顯微鏡的光路結(jié)構(gòu)，通過軟件來實(shí)現(xiàn)分辨率的突破呢？答案是有的，那就是我們的女主角反卷積。
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我們先看上面的圖，如圖所示理想的鏡頭成像時(shí)，一個(gè)對焦平面上的物點(diǎn)會(huì)投影為一個(gè)像點(diǎn)，但事實(shí)上理想的鏡頭是不存在的，鏡頭總是存在一些缺陷會(huì)導(dǎo)致一個(gè)物點(diǎn)會(huì)投影為很多點(diǎn)，一個(gè)點(diǎn)經(jīng)過鏡頭后成的像由點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)PSF(Point Spread Function)來描述。是不是聽起來有些懵？簡單給大家做個(gè)比喻，有美女或帥哥站在你的面前，理論上你可以清楚地看到他的容貌，但實(shí)際過程中你和美女帥哥之間多了一塊毛玻璃，這塊毛玻璃就是擴(kuò)散函數(shù)，那能不能把這塊毛玻璃打碎呢？可以的，這就需要用我們的女主角反卷積了。
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如圖所示，我們會(huì)有一個(gè)很自然的想法就是，如果我們有實(shí)際鏡頭的成像，另外還知道了鏡頭的PSF，即我們知道了上式的b和c，是否可以得到更加理想的成像x呢？這個(gè)過程稱為去卷積Deconvolution。
經(jīng)過上面的介紹，相信大家就會(huì)明白為什么我會(huì)把景深擴(kuò)展與反卷積稱為寬場顯微鏡最甜CP了吧。男主角景深擴(kuò)展充滿活力地在Z軸方向上下翻飛，優(yōu)化顯微鏡豎直方向的成像效果。女主角反卷積穩(wěn)重包容在水平方向突破自我。這里我還要提一點(diǎn)特別重要的，很多小伙伴認(rèn)為反卷積作為一種算法沒有硬件的改變是不是隨意搭配任何機(jī)型都可以實(shí)現(xiàn)。其實(shí)不然，每一個(gè)公司的每一個(gè)型號上的每一顆物鏡都只有唯一的反卷積公式。
最后總結(jié)一下，想必大家應(yīng)該明白我為什么去寫這篇文章了。在顯微觀察過程中存在很多不同的功能，我選擇跟成像質(zhì)量最相關(guān)的功能拿出來跟大家說一下，就是希望小伙伴們在學(xué)習(xí)與工作中更好的去使用顯微鏡。
口說無憑眼見為真嘛，大家可以用自己實(shí)驗(yàn)室的顯微鏡試一下這對CP的魅力，這兩個(gè)功能雖然在市面上很常見，但是能集二者與一身的顯微鏡并不多，怎么解決呢？歡迎大家來試用我們的ECHO顯微鏡吧。
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