一文攬盡：熒光定量PCR擴增曲線哪個階段最重要

qPCR擴增曲線一般分成四個階段：基線期、指數(shù)期、線性期和平臺期。那么每個階段PCR產(chǎn)物量的變化都有什么區(qū)別呢？哪個階段最重要呢？小編這就一一道來。

基線期

PCR起始時，剛開始前幾個循環(huán)的熒光信號還沒有發(fā)生變化，接近一條直線，將其稱之為基線，一般是3-15個循環(huán)。在基線期內(nèi)，擴增的熒光信號被背景熒光信號所掩蓋，無法判斷PCR產(chǎn)物量的變化。

指數(shù)期

擴增的熒光信號高于背景熒光信號，擴增曲線起峰，開始進入指數(shù)期。在指數(shù)期內(nèi)，每個循環(huán)積聚的產(chǎn)物準確加倍（假定100%反應效率）。該階段的PCR反應具有高度特異性和精確度。因為所有試劑均充足，反應的動力學推動反應有利于擴增子加倍，所以產(chǎn)物出現(xiàn)指數(shù)級擴增。只有在這個階段，Cq值與初始模板量的對數(shù)之間存在線性關系，所以在此階段進行定量分析最合適。

線性期（高變異性）

隨著PCR反應體系各成分的消耗，其中的一種或者多種成分限制反應，導致反應開始減緩，并且每個循環(huán)的PCR產(chǎn)物不再加倍，該階段不再是指數(shù)級擴增。

平臺期

反應停止，不再產(chǎn)生更多產(chǎn)物，并且如果放置時間夠長，PCR產(chǎn)物將開始降解。因為每個樣品具有不同的反應動力學，所以每支試管或每個反應將在不同的時間點進入平臺期，最終的產(chǎn)物含量也各不相同。

由于線性期和平臺期的擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR的產(chǎn)物量與初始模板量之間沒有線性關系，所以也不能通過這兩個階段的PCR產(chǎn)物量計算出初始模板量。想要知道初始模板量的多少，還要依賴指數(shù)期的Cq值進行計算。

▲ 圖1. qPCR 反應的重要階段
 

如圖所示，標準的擴增曲線是呈現(xiàn)S型的。曲線是否符合標準，不僅跟樣本起始量、qPCR體系配制、反應程序等相關，更依賴于一套高品質的實時熒光定量PCR系統(tǒng)。對于實時熒光定量PCR系統(tǒng)來說，高度檢測靈敏度、高度重復性和高度穩(wěn)定性，是每一臺qPCR儀的追求。

高性能的Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)完全符合以上要求，該系統(tǒng)來自美國Azure Biosystems公司，融合了高品質的帕爾特溫度模塊和基于光纖傳輸?shù)墓鈱W檢測系統(tǒng)，為您的科學研究提供高精準、高靈敏可靠結果。提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根據(jù)實驗需求靈活配置。

同時配有10.3”觸控系統(tǒng)，主機本身可獨立運行、連接、遠程交互，讓您隨時隨地知悉實驗進程和及時獲得實驗結果。

▲ 圖2. Azure Cielo™ 實時熒光定量PCR系統(tǒng)

高度的靈敏度

使用探針法，同時在Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)和其他品牌產(chǎn)品上檢測GAPDH基因，結果表明：A）Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)對單拷貝基因的檢出率更高。B）Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)的Cq平均值要低于2個Cq。

▲ 圖3. 單拷貝基因檢測對比(n=96)

高度的重復性

源于優(yōu)異的孔間均一性。105拷貝數(shù)GAPDH模板，GAPDH引物擴增，96孔重復結果。Cq平均值=19.1，變異系數(shù)（Cv）=0.002。

▲ 圖4. 96孔重復擴增曲線   A）線性圖  B）對數(shù)圖

高度的穩(wěn)定性

穩(wěn)定可靠的溫度模塊和光學系統(tǒng)，確保儀器連續(xù)運行1000輪qPCR實驗，數(shù)據(jù)依然穩(wěn)定可靠，重復性高度一致。對GAPDH進行檢測并連續(xù)計算Cq值得出平均值和Cq值的標準偏差。Cq值=22.4+0.01。

▲ 圖5. 長時間連續(xù)工作數(shù)據(jù)穩(wěn)定