qPCR擴增曲線的問題綜述與解決方法總結(jié)

大家好！首先跟大家做一個自我介紹：

我是擴增曲線，來自熒光定量PCR，是用于描述qPCR動態(tài)進程的曲線，我有兩種形態(tài)，一種是線性圖譜：橫坐標(biāo)是循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)是熒光強度值；另一種是對數(shù)圖譜：橫坐標(biāo)是循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)是熒光強度值的對數(shù)。大家根據(jù)我來確定Cq值，最終確定初始模板的含量。新冠疫情以來，我可是發(fā)揮了重要的作用，診斷技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，驕傲的很呢。
 

在引物、模板、緩沖液、酶等都充足的理想狀態(tài)下，PCR擴增產(chǎn)物理論上是呈2的倍數(shù)增長的，所以我應(yīng)該是長這個樣子的：

▲ 圖1. 理論的擴增曲線線性圖譜
 

但是呢，理想很美好，現(xiàn)實卻很骨感，隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，DNA聚合酶的失活、dNTP和引物的枯竭等諸多因素影響了PCR擴增效率，實際的我是長這樣的：
 

▲ 圖2. 實際的擴增曲線線性圖譜
 

不過S型的曲線，曼妙的身材，我還是很滿意的。

大家也根據(jù)我將PCR進程分為4個時期，分別為基線期，指數(shù)增長期，線性增長期和平臺期。我的特征還是很明顯的：基線期平整；指數(shù)期起峰，陡度較大；線性期慢慢趨于平整；平臺期基本平整。
 

▲ 圖3. 擴增曲線的各個時期
 

如果大家在每次實驗中都能遇到如此美麗的我，那就是“你好我好大家好”的歡快場景了。但是在實驗過程中，大家可能會看到各種奇形怪狀的我，分析不出原因，導(dǎo)致實驗止步不前，因此茶飯不思，郁郁寡歡。

其實主要還是大家對我不太了解。我，作為大家的科研小助手，單純善良，心思簡單，沒有那么多套路的。之所以出現(xiàn)奇奇怪怪的我，都是有原因的。接下來可都是滿滿的干貨吆！筆記要做起來了吆！

一． 沒有Cq值出現(xiàn)

1. 反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般設(shè)定在35個循環(huán)以上，也可根據(jù)實驗情況增加循環(huán)數(shù)。

2. 引物/探針設(shè)計不當(dāng)或發(fā)生降解：優(yōu)化引物/探針的設(shè)計；或通過PAGE電泳檢測其完整性。

3. 模板濃度低或降解導(dǎo)致：對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起；同時樣品制備時盡量避免引入雜質(zhì)和反復(fù)凍融。
 

二．Cq值偏大

1. 模板濃度低：建議提高樣本的上樣量。

2. 擴增效率低：反應(yīng)條件不適宜或引物探針設(shè)計不當(dāng)，建議通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線確認(rèn)擴增效率，同時對反應(yīng)條件和引物探針設(shè)計進行優(yōu)化。

3. PCR產(chǎn)物太長：一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。如果擴增產(chǎn)物過長，建議用三步法程序擴增或優(yōu)化引物。

4. 反應(yīng)體系中可能有PCR反應(yīng)抑制物：建議將模板梯度稀釋后加入反應(yīng)體系，或者重新制備純度更高的模板。
 

三．?dāng)U增曲線末尾起跳，但沒有完整擴增

1. 可能存在污染：建議對樣本進行復(fù)檢。

2. 如果是陰性對照，可能是引物二聚體或污染導(dǎo)致；如果是正常樣本，說明濃度過低或者加樣量不足。
 

四．復(fù)孔重復(fù)性差

1. 加樣誤差導(dǎo)致：定期校準(zhǔn)移液器；同時可先配制除模板以外的其他試劑的預(yù)混液，然后進行分裝再加入模板，其次加大模板上樣體積，以上均可降低移液誤差的影響。

2. 模板濃度越低，重復(fù)性越差。建議提高模板量，使Ct值在15-30之間。

 

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