數(shù)字PCR在華盛頓大學(xué)監(jiān)測(cè)HIV病毒和SARS-CoV-2感染研究的應(yīng)用

COVID-19大流行中斷了對(duì)艾滋病病毒感染者的常規(guī)護(hù)理，嚴(yán)重影響了對(duì)艾滋病病毒感染者的診斷和治療。如果感染SARS-CoV-2, 艾滋病病毒感染者的發(fā)病率和死亡率會(huì)增加。據(jù)報(bào)道，近日在南非發(fā)現(xiàn)新冠新型變異毒株Omicron可能由艾滋患者體內(nèi)進(jìn)化而來(lái)。因此密切監(jiān)測(cè)HIV血漿病毒載量（VL）并篩查SARS-COV-2感染就顯得尤為迫切。近日，來(lái)自華盛頓大學(xué)的Gaurav K Gulati和Nuttada Panpradist等科學(xué)家在medRxiv平臺(tái)上提交文章《Inexpensive workflow for simultaneous monitoring of HIV viral load and detection of SARS-CoV-2 infection》的預(yù)印本。
 

通過(guò)開(kāi)發(fā)一種新的工作流程，同時(shí)定量艾滋病毒載量和檢測(cè)SARS-CoV-2。文中使用naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對(duì)RNA濃度進(jìn)行精準(zhǔn)定量，用于新方案的評(píng)估。
 

文章中作者基于Boom方法開(kāi)發(fā)了一種內(nèi)部RNA提取方法，從血漿、鼻腔分泌物（NS）或二者混合物中進(jìn)行RNA提取，對(duì)HIV長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR） 、SARS-CoV-2核衣殼基因區(qū)域（N1、N2）和人類核糖核酸酶 P(RP)進(jìn)行RT-qPCR分析，估計(jì)血漿病毒載量并對(duì)HIV/SARS-CoV-2狀態(tài)進(jìn)行分類（HIV為病毒學(xué)失敗或抑制，SARS-CoV-2為陽(yáng)性、假定陽(yáng)性、陰性或不確定）。
 

首先，作者將包含HIV LTR檢測(cè)擴(kuò)增區(qū)域或N1/N2檢測(cè)的DNA片段作為RNA生成的起始DNA構(gòu)建體。使用 T7 RNA聚合酶將DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化為RNA。為了對(duì)體外轉(zhuǎn)錄的RNA濃度進(jìn)行精準(zhǔn)定量，作者使用naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對(duì)RNA濃度進(jìn)行絕對(duì)定量（圖1）。從圖中可以看出通過(guò)檢測(cè)OD值并不能對(duì)RNA濃度進(jìn)行精準(zhǔn)定量，因此最終利用數(shù)字PCR的結(jié)果對(duì)RNA的濃度進(jìn)行了校正。
 

圖1:數(shù)字PCR量化體外轉(zhuǎn)錄的RNA標(biāo)準(zhǔn)濃度
 

隨后將合成的不同濃度的HIV RNA與血漿樣本進(jìn)行混合構(gòu)成人造血漿樣本，合成的不同濃度的SARS-CoV-2 RNA與NS進(jìn)行混合構(gòu)成人造NS樣本，分別采用內(nèi)部提取方法和標(biāo)準(zhǔn)提取方法對(duì)血漿樣本中HIV、NS樣本中SARS-CoV-2和血漿和NS混合樣本中HIV和SARS-CoV-2進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。同時(shí)采用133個(gè)臨床樣本，其中40個(gè)血漿樣本（30個(gè)HIV血清陽(yáng)性），67個(gè)NS樣本（31個(gè)SARS-CoV-2陽(yáng)性）和26個(gè)血漿和NS混合樣本（26個(gè)HIV陽(yáng)性，10個(gè)SARS-CoV-2陽(yáng)性）進(jìn)行評(píng)價(jià)（圖2）。
 

結(jié)果表明：內(nèi)部提取對(duì)HIV的檢測(cè)限為200拷貝/mL，對(duì)SARS-CoV-2的檢測(cè)限為100拷貝/mL。對(duì)于血漿樣本，兩種方法測(cè)量的HIV病毒載量水平呈正相關(guān)（人造樣本的R2：0.98, 臨床樣本R2: 0.81）。在對(duì)NS樣本使用內(nèi)部提取方法時(shí)，排除不確定結(jié)果，與標(biāo)準(zhǔn)提取方法相比，95%的一致性（25個(gè)陽(yáng)性，6個(gè)假定陽(yáng)性和31個(gè)陰性）。對(duì)于血漿和NS混合樣本，兩種方法測(cè)量的HIV病毒載量水平呈正相關(guān)（人造樣本的R2：0.98, 臨床樣本R2: 0.71）。SARS-CoV-2檢測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性和陰性分類是100%一致性。
 

 

圖2：使用兩種不同提取方法從血漿和NS混合樣本中共同提取的RNA中獲得的HIV LTR 和SARS-CoV-2 Cq值的比較.（a）比較標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)部提取方法性能的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。（b）來(lái)自內(nèi)部提取方法的SARS-CoV-2 LTR、N1、N2和人 RP （陰性樣本的對(duì)照）測(cè)定的Cq值。（c）基于兩種提取方法的結(jié)果對(duì)樣本進(jìn)行分類。通過(guò)兩種方法提取的樣本中測(cè)得的（d）LTR、（e）N1和（f）N2的散點(diǎn)圖。

綜上所述，作者開(kāi)發(fā)的內(nèi)部提取方法可以從單獨(dú)的血漿或血漿和NS混合樣本提取RNA來(lái)確定艾滋病病毒感染者是否存在SARS-CoV-2感染，從而有可能簡(jiǎn)化HIV管理和SARS-CoV-2檢測(cè)。將這兩種病毒的檢測(cè)結(jié)合起來(lái)可以有效的減少COVID-19對(duì)艾滋病毒治療的影響。
 

medRxiv是由耶魯大學(xué)（Yale University）、非營(yíng)利研究和教育機(jī)構(gòu)冷泉港實(shí)驗(yàn)室(The Cold Spring Harbor Laboratory，CSHL)和BMJ出版集團(tuán)（英國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)下屬專業(yè)醫(yī)學(xué)出版機(jī)構(gòu)，British Medical Journal）創(chuàng)建的，服務(wù)器由CSHL擁有和操作。medRxiv為研究人員在期刊出版前分享、評(píng)論和接收有關(guān)其工作的反饋提供了一個(gè)平臺(tái)。medRxiv旨在提高科學(xué)發(fā)現(xiàn)的開(kāi)放性和可及性，加強(qiáng)研究人員之間的協(xié)作，記錄想法的來(lái)源，并通過(guò)更及時(shí)地報(bào)告已完成的研究，為正在進(jìn)行和計(jì)劃的研究提供信息。

原文：https://doi.org/10.1101/2021.08.18.21256786
 

naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國(guó)Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測(cè)，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)濃度。