Nature 解鎖新機制，p53 與鐵死亡的關(guān)系
眾所周知，p53 是一種腫瘤抑制基因，被廣泛稱為“基因組的守護者”。自 1979 年被發(fā)現(xiàn)至今，p53 基因一直是分子生物學和腫瘤學的研究熱門。據(jù) Elie Dolgin 在 Nature 上發(fā)表的 “The most popular genes in the human genome” 統(tǒng)計，截至 2017 年，PubMed 數(shù)據(jù)庫中研究最多的基因列表——一種人類基因組的“熱門基因”，TP53 榮得桂冠。
Gaurav Mendiratta 等人在 2021 年發(fā)表的“Cancer gene mutation frequencies for the U.S. population” 中，通過結(jié)合基因組 (所有癌癥中每個基因中包含一個或多個突變的估計比例) 和流行病學數(shù)據(jù)也統(tǒng)計了美國人群中基因突變的頻率，發(fā)現(xiàn) TP53 是最常見的突變基因 (35%)。
圖 1 左：截至 2017 年，PubMed 數(shù)據(jù)庫中研究最多的基因列表[1] 圖 1 右：癌癥患者群體中重要基因組的流行病學加權(quán)基因突變比例[2]
p53 是一種抑癌基因，位于人的 17 號染色體的短臂上，可以編碼和表達 p53 蛋白。p53 可以被許多應激信號誘導后，以四聚體形式與 DNA 結(jié)合，然后以序列特異性方式參與到某些介導關(guān)鍵細胞過程基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，例如細胞周期停滯、DNA 修復、衰老和細胞凋亡。激活 p53 蛋白信號通路的方法之一是對 DNA 模板完整性的破壞。如圖 2，各種應激導致不同類型的 DNA 損傷，從而通過導致 p53 蛋白磷酸化、乙�；�、甲基化、泛素化或 sumolation 的翻譯后修飾。
圖 2. p53 蛋白作為腫瘤抑制因子的中心作用[4]
鐵死亡 (Ferroptosis)，是一種新型的調(diào)節(jié)性細胞死亡形式；其形態(tài)學特征是線粒體膜密度濃縮，線粒體嵴減少或消失，線粒體外膜破裂 (見：鐵死亡是什么，如何檢測？您要的“一文通”來了!)。p53 可以通過抑制 SLC7A11 的表達來增強鐵死亡。SLC7A11 是 System x- (抗氧化體系)的亞基，負責主要的轉(zhuǎn)運活性，抑制 System xc- 的活性會抑制胱氨酸的吸收，影響 GSH 的合成，繼而導致膜脂修復酶 GPX4 活性降低，使得細胞抗氧化能力降低，從而促進鐵死亡。
顧偉團隊早在 2015 年于 Nature 上發(fā)表的 “Ferroptosis as a p53-mediated activity during tumour suppression” 中已證明 p53 通過抑制 SLC7A11 (胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白的關(guān)鍵成分) 的表達來抑制胱氨酸攝取，并且使細胞對鐵死亡敏感。
如圖 4，四環(huán)素處理對親代 H1299 細胞中 SLC7A11 的表達沒有明顯影響，但在四環(huán)素調(diào)控 (tet-on) p53 誘導的細胞系中發(fā)現(xiàn)，p53 激活嚴重降低了 SLC7A11 蛋白水平 (圖 4a)。當 p53 shRNA (p53 敲低)通過 Nutlin-3 (p53-MDM2 抑制劑) 處理，SLC7A11 蛋白質(zhì)水平?jīng)]有受到明顯的影響 (圖 4b)。這些數(shù)據(jù)表明 SLC7A11 基因是 p53 介導的轉(zhuǎn)錄抑制的靶標。
隨后，作者團隊使用 p533KR 細胞進行實驗，這是一種無法誘導細胞周期停滯、衰老和凋亡的乙�；毕萃蛔凅w細胞。他們發(fā)現(xiàn)在沒有 Tet-on 誘導的情況下，p533KR 細胞對 Erastin 介導的鐵死亡具有很強的抵抗力，SLC7A11 的過表達會挽救 p533KR 依賴性細胞鐵死亡 (圖 4c)。此外，在體內(nèi)外實驗中，SLC7A11 的過表達會大大減弱 p533KR 的腫瘤抑制作用 (圖 4d-e)。
a: Doxycycline 處理的 tet-on p53 穩(wěn)定系細胞的蛋白質(zhì)印跡；b: Nutlin 處理的 p53 敲低的 U2OS 細胞蛋白質(zhì)印跡分析；c-d: 用對照或過表達 SLC7A11 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Tet-on p533KR 細胞的鐵死亡情況以及細胞的異種移植腫瘤重量
另外作者團隊還發(fā)現(xiàn)高水平的活性氧 (ROS) 可以觸發(fā) p53 介導的鐵死亡。
如圖 5a，單獨的 p533KR 誘導或 ROS 激活劑處理中均未觀察到明顯的細胞死亡；而 p533KR+ROS 組誘導了大量細胞死亡，SLC7A11 的過表達可以挽救這種死亡（5b）。
a-b: 四環(huán)素和 ROS 處理對照或過表達 SLC7A11 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Tet-on p533KR 細胞的死亡情況；
■ ALOX12 是 p53 介導的鐵死亡途徑必不可少的
顧偉團隊深入研究，于 2019 年在 Nature Cell Biology 上發(fā)表了“ALOX12 is required for p53-mediated tumour suppression through a distinct ferroptosis pathway”文章，指出 ALOX12 介導的、不依賴 ACSL4 的鐵死亡途徑對 p53 介導的腫瘤抑制作用非常重要。ALOX12 基因位于人類染色體 17p13.1，這是人類癌癥中單等位基因缺失的熱門位點。
該團隊首先驗證了 ALOX12 對于 ROS 應激下 p53 介導的鐵死亡是必不可少的。他們發(fā)現(xiàn) ALOX12 耗竭對 p53 水平或其轉(zhuǎn)錄靶標 (例如 SLC7A11、Mdm2 和 p21) 的表達沒有明顯影響，但可以挽救 p53 介導的鐵死亡 (圖 6a-b)。
隨后，他們發(fā)現(xiàn)在 ROS 應激下 p53 介導的鐵死亡獨立于 GPX4 調(diào)節(jié)。如圖 6c，在 GPX4 敲除細胞中可以檢測到高水平的內(nèi)源性脂質(zhì)過氧化，而 GPX4 異位表達后，脂質(zhì)過氧化水平顯著降低。同時，RSL-3 (GPX4 抑制劑) 可以抑制 GPX4 對脂質(zhì)過氧化的減少作用，而 p53 的激活對其沒有任何影響。
接著，作者團隊研究 ALOX12 對于 p53 介導的腫瘤生長抑制的影響。研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素誘導的 p533KR 表達會顯著降低腫瘤細胞的生長；而 ALOX12 基因敲除會大大的抑制 p533KR 的腫瘤抑制作用。這表明 ALOX12 對 p53 的腫瘤細胞生長抑制活性至關(guān)重要。
a: U2OS 細胞的蛋白質(zhì)印跡分析；b: 不同藥物處理 U2OS 細胞死亡情況；c: 細胞脂質(zhì)過氧化水平的變化；d: H1299 Tet-on p533KR 和 ALOX12 敲除鼠的異種移植腫瘤情況。
■ iPLA2β 是 p53 介導的鐵死亡途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子
今年 6 月，該團隊又在 Nature Communications 上發(fā)表了“iPLA2β-mediated lipid detoxification controls p53-driven ferroptosis independent of GPX4”，再次指出 iPLA2β 是在高 ROS 應激條件下 p53 激活誘導的鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。同時，p53 以不依賴 GPX4 的方式誘導鐵死亡。
圖 7. ALOX12 和 iPLA2β 在調(diào)節(jié) p53 介導的鐵死亡中的作用模型[16]
作者團隊發(fā)現(xiàn) p53 以不依賴 GPX4 方式介導鐵死亡。
他們首先在 ACSL4/GPX4 雙基因敲除 (ACSL4-/-/GPX4-/-) 的人骨肉瘤細胞系 U2OS 中發(fā)現(xiàn): p53 水平不受 ACSL4 和 GPX4 的影響，同時 p53 介導的 p21 轉(zhuǎn)錄激活或 SLC7A11 的抑制也基本沒有變化 (圖 8a)。然而，當 ACSL4-/-/GPX4-/- 細胞暴露于TBH 和 Nutlin 時，我們很容易能觀察到細胞鐵死亡，并且可以被鐵死亡抑制劑，特異性阻斷 (圖 8b)。
a: Nutlin 對 U2OS 細胞 p53 蛋白的影響；b: TBH、Nutlin、Ferr-1、Lipro-1、3-MA、Necrostatin-1、Z-VAD-FMK 對 WT 和 ACSL4-/-/GPX4-/- U2OS 細胞死亡的影響
總結(jié)：
抑癌基因 p53，在腫瘤領(lǐng)域的熱度，絕對是處于第一梯隊的。鐵死亡是一種新型的調(diào)節(jié)性細胞死亡形式，自被發(fā)現(xiàn)就引起了研究狂潮，熱度不減。p53 與鐵死亡結(jié)合的研究發(fā)現(xiàn)，拓展了 p53 新的調(diào)控腫瘤發(fā)展的機制，也為研究出腫瘤抑制作用的新型藥物開辟了新的方向。雖前路漫漫，但未來可期！
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相關(guān)產(chǎn)品 |
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一種有效的 MDM2 抑制劑；可抑制 MDM2-p53 相互作用，穩(wěn)定 p53 蛋白，從而誘導細胞自噬和凋亡。 |
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一種有效的 p53-MDM2 抑制劑，Ki 為 90 nM。 |
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一種有效，選擇性的 MDM2 拮抗劑，能夠抑制 p53-MDM2 的結(jié)合，IC50 值為 6 nM。 |
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一種 p53 抑制劑，可阻斷其轉(zhuǎn)錄活性并阻止細胞凋亡；一種 aryl hydrocarbon receptor (AhR) 的激動劑。 |
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鐵死亡誘導劑；結(jié)合且抑制電壓依賴性陰離子通道 (VDAC2/VDAC3)。 |
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谷胱甘肽過氧化物酶 4 (GPX4) 的抑制劑 (ferroptosis 激動劑)，可降低 GPX4 的表達。 |
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選擇性的 ferroptosis 抑制劑；抗氧化劑。 |
參考文獻
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16. Delin Chen, Wei Gu, et al. iPLA2β-mediated lipid detoxification controls p53-driven ferroptosis independent of GPX4. Nat Commun. 2021 Jun 15;12(1):3644.
