病毒克星：Marchf2基因與Marchf2基因敲除小鼠的介紹應(yīng)用

圖1. MARCHf2蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測模型^[3]。

與Marchf2相關(guān)的疾病包括鎖骨下動(dòng)脈竊血綜合征和肺曲菌球病。該基因的一個(gè)重要同源基因是Marchf3^[4]。

Marchf2基因敲除小鼠
Marchf2基因敲除純合小鼠對(duì)細(xì)菌或病毒感染具有更高的的抵抗力，接種細(xì)菌或病毒后其載量更少，敲除小鼠的細(xì)胞因子產(chǎn)生增加，但脂多糖誘導(dǎo)后致死率增加^[5]。

研究人員為了評(píng)估Marchf2在先天免疫反應(yīng)中的作用，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在C57BL/6背景的小鼠上敲除Marchf2基因，產(chǎn)生了Marchf2^-/-小鼠，并驗(yàn)證了Marchf2的基因敲除。

Marchf2敲除小鼠沒有表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)的異常。研究人員為了進(jìn)一步研究Marchf2在體內(nèi)病毒感染中的作用，將VSV-GFP通過靜脈注射到Marchf2^+/+和Marchf2^-/-小鼠中進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)（圖 2A）。結(jié)果Marchf2敲除小鼠的血清中病毒的載量要比Marchf2^+/+小鼠的血清中的少。

此外，研究人員在研究血清中細(xì)胞因子的含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，Marchf2敲除小鼠血清中的IFN-β、IL-6、IL-12和TNF-α的濃度高于Marchf2^+/+小鼠（圖2B）。此外，研究人員還向小鼠注射了病毒RNA模擬配體poly(I:C)，并檢測了血清中細(xì)胞因子的表達(dá)水平（圖2C），結(jié)果顯示，使用配體進(jìn)行刺激后，Marchf2敲除小鼠的血清中許多細(xì)胞因子表達(dá)水平高于Marchf2^+/+小鼠血清中細(xì)胞因子的表達(dá)水平。以上這些結(jié)果表明Marchf2參與體內(nèi)抗病毒的免疫反應(yīng)。

研究人員為了進(jìn)一步研究Marchf2在響應(yīng)細(xì)菌感染過程中的作用，研究人員用致死劑量的李斯特菌 (Lm)對(duì)Marchf2^+/+和Marchf2^-/-小鼠進(jìn)行了攻毒實(shí)驗(yàn)。如圖2D和E所示，Marchf2敲除小鼠比Marchf2^+/+小鼠更能抵抗細(xì)菌感染。

為了檢查敲除Marchf是否會(huì)對(duì)病原體清除產(chǎn)生影響，我們使用菌落形成單位 (CFU) 滴定法檢測了敲除小鼠和野生型小鼠中脾臟和肝臟中的細(xì)菌載量（圖2F和G）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Marchf2敲除小鼠兩種器官中的細(xì)菌載量明顯低于Marchf2^+/+小鼠中的載量。

接下來，研究人員探究了Marchf2敲除小鼠在攻毒后的低細(xì)菌載量現(xiàn)象是否是由于這些動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生更劇烈的炎癥反應(yīng)。研究人員將來自Marchf2敲除小鼠和Marchf2^+/+小鼠的血清、脾臟和肝臟樣本中的細(xì)胞因子含量進(jìn)行了檢測比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，來自Marchf2敲除小鼠組織中的IL-6、IL-12、CCL5和CXCL10都有較高的表達(dá)（圖2H-J）。以上這些結(jié)果還顯示Marchf2參與體內(nèi)抗菌免疫反應(yīng)的過程。
 

圖2. Marchf2的敲除增強(qiáng)了體內(nèi)的抗菌抗病毒免疫反應(yīng)。

(A,B)向Marchf2^+/+ (n=8)或Marchf2^-/- (n=8)小鼠靜脈注射VSV-GFP (2^*10⁸PFU/小鼠) 進(jìn)行靜脈內(nèi)感染，并在感染12小時(shí)后收集血清樣本. (A)使用噬斑試驗(yàn)分析病毒滴度。(B)使用ELISA檢測了IFN-β、IL-6、IL-12和TNF-α的表達(dá)量。

(C)向Marchf2^+/+(n=6)或Marchf2^-/- (n=6) 小鼠靜脈注射poly (I:C)（200微克/小鼠）。在感染后2小時(shí)收集血清樣品，并用ELISA測量IFN-b、IL-6、IL-12和TNF-a的表達(dá)量。

(D-J)向Marchf2^+/+(n=8)、Marchf2^-/-(n=8)小鼠腹腔注射1*10⁶CFU的李斯特菌。(D) 顯示了每組存活小鼠的占比，E圖顯示了體重變化。(F,G)研究人員在攻毒后3h，采集并檢查了脾 (F)和肝臟(G)中的細(xì)菌的載量。

(H–J)研究人員檢測了攻毒后24h每組小鼠血清(H)、脾(I)和肝臟(J)中炎癥因子IL-6、IL-12、CCL5和CXCL10的表達(dá)量^[6]。

為了探究Marchf2是否與脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的感染性休克有關(guān)，研究人員采用腹腔注射的方式將LPS打入Marchf2^+/+和 Marchf2敲除小鼠中。所有Marchf2^+/+小鼠都存活下來，而超過60%的Marchf2敲除小鼠死亡（圖 3A 和 B）。這些結(jié)果表明Marchf2^-/-小鼠比Marchf2^+/+小鼠更容易受到內(nèi)毒素休克的影響。

此外，脾臟切片的H&E染色顯示Marchf2^-/-小鼠的炎癥細(xì)胞浸潤比 Marchf2^+/+小鼠更嚴(yán)重（圖3C）。因此，研究人員猜測Marchf2參與LPS介導(dǎo)的感染性休克時(shí)的炎癥反應(yīng)。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，研究人員使用ELISA檢測了血清中多種細(xì)胞因子的表達(dá)量（圖2D）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Marchf2^+/+小鼠相比，Marchf2^-/-小鼠多種細(xì)胞因子有著更高的表達(dá)量�？偟膩碚f，這些結(jié)果表明 Marchf2是針對(duì)病毒和細(xì)菌感染的先天免疫反應(yīng)過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑^[6]。
 

圖3. Marchf2的敲除對(duì)LPS引起的感染性休克易感性的影響。

(A,B)向Marchf2^+/+ (n=8) 或Marchf2^-/- (n=8)小鼠腹腔注射LPS(24 mg/kg)。每組中存活小鼠的百分比和體重變化。(C) 向Marchf2^+/+ (n = 4)或Marchf2-/- (n=4)小鼠腹腔注射LPS (24mg/kg)。圖片為各組脾臟切片及H&E染色的結(jié)果。D 向Marchf2^+/+ (n=6)或Marchf2^-/- (n=6)小鼠腹腔注射LPS (24mg/kg)，并通過ELISA在12hpc時(shí)測量各組小鼠血清中IL-6、TNF-α、CXCL-10和CCL-5的水平。

小結(jié)
在感染的后期Marchf2能和NF-κB調(diào)控因子（NEMO）相互作用，并進(jìn)一步激活炎癥通路相關(guān)因子的表達(dá)。敲除Marchf2可以增加小鼠對(duì)細(xì)菌和病毒感染的抵抗性，并能增強(qiáng)先天免疫應(yīng)答。這個(gè)基因在病毒的感染中發(fā)揮著重要的作用，是不是在新冠藥物的開發(fā)中，也可以作為一個(gè)靶點(diǎn)呢？