影響qPCR最終效果的六個(gè)要素分析與解決方法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)（探針或染料），利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程，最后通過(guò)Cq或Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行絕對(duì)定量或相對(duì)定量分析。而評(píng)估熒光定量PCR反應(yīng)效果好壞，可以從以下幾個(gè)方面來(lái)評(píng)估：
 

1.擴(kuò)增效率及相關(guān)系數(shù)

良好的PCR擴(kuò)增是指數(shù)級(jí)的，理論上以100%的效率進(jìn)行，但實(shí)際上并不是所有的PCR反應(yīng)都表現(xiàn)出相同的高效率，所以需要驗(yàn)證實(shí)際的擴(kuò)增效率E。當(dāng)計(jì)算評(píng)估PCR擴(kuò)增效率時(shí)，至少需要做3次平行重復(fù)，并至少做5個(gè)數(shù)量級(jí)倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度，得到線性方程Cq= -klgX₀+b、擴(kuò)增效率E=10^(-1/k)-1。并且E在0.9-1.1之間，即擴(kuò)增效率在90-110%，被認(rèn)為此擴(kuò)增接近理想情況；相關(guān)系數(shù)R²值大于0.98時(shí)，說(shuō)明兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好，可用來(lái)計(jì)算。
 

▲ 圖1. 5個(gè)梯度稀釋液的擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖源：Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)
 

2.精確度（Precision）

指多個(gè)復(fù)孔Cq值之間的接近程度，且重復(fù)孔之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于0.2，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好。

▲ 圖2. 96孔重復(fù)的擴(kuò)增曲線，Cq Mean=19.1，CV=0.002

圖源：Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)
 

3. 重現(xiàn)性（Reproducibility）

指不同批次之間或不同實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果變化，通常通過(guò)SD或者CV來(lái)評(píng)估。

▲ 圖3. 4臺(tái)獨(dú)立的Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè)GAPDH，Cq Mean=20.11，SD= 0.002
 

4. 靈敏度（Sensitivity）

通常靈敏度表示為檢測(cè)限(limit of detection, LOD)，可通過(guò)梯度稀釋樣品來(lái)確定最低檢測(cè)限。分析靈敏度是指一個(gè)樣本可通過(guò)實(shí)驗(yàn)精確測(cè)量的最小拷貝數(shù)。
 

5. 準(zhǔn)確度（Accuracy）

指測(cè)量值與真實(shí)值的接近程度。針對(duì)低拷貝樣本，由于受采樣概率的影響，可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。為了更可靠地檢測(cè)低拷貝，可以增大平行實(shí)驗(yàn)的重復(fù)數(shù)，來(lái)統(tǒng)計(jì)顯著性。
 

▲ 圖4. 低拷貝樣本采樣概率符合泊松分布

圖源：網(wǎng)絡(luò)，侵刪
 

6. 特異性（Specificity）

指qPCR實(shí)驗(yàn)中只可以檢測(cè)到目的基因，引物特異性擴(kuò)增靶序列，而不會(huì)擴(kuò)增其他基因序列�？赏ㄟ^(guò)凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物是否為單一條帶，或通過(guò)qPCR反應(yīng)，根據(jù)溶解曲線是否具有單峰來(lái)判斷。

▲ 圖5. 溶解曲線單峰

圖源：Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)

通過(guò)這六個(gè)方面就可以評(píng)估實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)效果。你學(xué)會(huì)了嗎？實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是好是壞快來(lái)自檢吧。

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