Vac8/ARMC3在PtdIns3P激酶復(fù)合體錨定在自噬起始位點(diǎn)的作用

8月23日，四川大學(xué)盧克鋒、許文明團(tuán)隊(duì)在Developmental Cell上發(fā)表了一篇題為“Autophagic elimination of ribosomes during spermiogenesis provides energy for flagellar motility”的新研究，揭示了Vac8/ARMC3在PtdIns3P激酶復(fù)合體錨定在自噬起始位點(diǎn)的作用，以及其在生殖組織特異性自噬中的重要生理功能。
 

研究背景
自噬是一種進(jìn)化上保守的真核生物中的降解機(jī)制。對于簡單的真核生物如單細(xì)胞酵母，自噬最基本的功能是在營養(yǎng)饑餓時(shí)被激活，進(jìn)而降解胞內(nèi)物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)物質(zhì)再循環(huán)從而度過該階段。對于復(fù)雜的多細(xì)胞真核生物，例如哺乳動(dòng)物，自噬具有抵抗?fàn)I養(yǎng)饑餓之外的其他重要功能。

精子從精原細(xì)胞歷經(jīng)減數(shù)分裂成為圓形精子細(xì)胞，然后經(jīng)歷一系列的形態(tài)變化和功能轉(zhuǎn)變，形成伸長的成熟精子。在精子的發(fā)生過程中，有一個(gè)重要變化就是精子中的多余細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)的去除。自噬的功能之一就是在營養(yǎng)缺乏或者受到刺激時(shí)將細(xì)胞中多余的蛋白質(zhì)或者細(xì)胞器等降解回收以供細(xì)胞重新利用。

該研究表明在多細(xì)胞生物中，在某些情況下，特別是當(dāng)細(xì)胞突然需要增加新陳代謝時(shí)，自噬被激活以降解胞內(nèi)物質(zhì)從而滿足細(xì)胞自主方式的物質(zhì)和能量需求。

技術(shù)路線
構(gòu)建ARMC3敲除小鼠
Vac8/ARMC3 在生殖組織特異性自噬中的功能分析
機(jī)制研究

技術(shù)方法
轉(zhuǎn)錄組學(xué)、質(zhì)譜、免疫共沉淀、QPCR、免疫熒光染色等。

研究結(jié)果

1// 如同其酵母同源Vac8在自噬中發(fā)揮作用，ARMC3在小鼠睪丸中也有著類似的自噬功能
首先，研究人員利用ARMC3^+/+和ARMC3^-/-兩種老鼠（ARMC3^-/-，由賽業(yè)生物提供），在小鼠睪丸組織中驗(yàn)證了ARMC3仍然與酵母同源Vac8的互作蛋白PIK3C3-C1進(jìn)行互作，ARMC3的敲除也會(huì)導(dǎo)致小鼠睪丸組織中自噬的阻斷。另外自噬的底物p62在ARMC3^-/-睪丸組織的精子延長階段累積，并且電鏡觀察到ARMC3^-/-小鼠精子自噬體形成缺陷。
 

圖1：A. ARMC3^-/-小鼠睪丸蛋白互作驗(yàn)證；B-C. ARMC3^-/-小鼠睪丸檢測自噬情況；D.在ARMC3^-/-小鼠睪丸切片觀察自噬底物p62的定位；E. 在ARMC3^-/-小鼠電鏡觀察自噬體F. ARMC3^-/-小鼠睪丸切片觀察PI3KC3-C1蛋白定位。

2//  ARMC3的敲除影響精子運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致雄性小鼠不育
ARMC3敲除不影響小鼠的睪丸大小體積、精子的生成和形態(tài)，但是嚴(yán)重影響小鼠精子的運(yùn)動(dòng)能力，從而導(dǎo)致ARMC3^-/-雄性小鼠完全不育。經(jīng)過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠精子運(yùn)動(dòng)能力大幅減弱是因?yàn)锳RMC3敲除從而導(dǎo)致小鼠睪丸和精子的線粒體能量水平低（JC-1綠色和Mito-tracker熒光強(qiáng)度弱），在精子中具有彌漫性線粒體嵴的空泡化線粒體。
 

圖2：A. ARMC3^-/-小鼠完全不育；B. ARMC3^-/-小鼠睪丸大小形態(tài)無差異；C. ARMC3^-/-小鼠睪丸切片HE染色；D.精子計(jì)數(shù)；E. ARMC3^-/-小鼠精子運(yùn)動(dòng)能力檢測；F-G. ARMC3^-/-小鼠睪丸和精子ATP含量檢測；H. ARMC3^-/-小鼠精子檢測JC-1和Mito-tracker；I.電鏡觀察精子線粒體。

3//  ARMC3的敲除導(dǎo)致核糖體蛋白在小鼠精子累積
通過蛋白組學(xué)，研究人員發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白在ARMC3^-/-的小鼠精子明顯大量累積，28個(gè)核糖體蛋白亞基蛋白豐度全部上調(diào)。通過Western Blot驗(yàn)證了其中的七個(gè)核糖體亞基蛋白，并且通過免疫熒光驗(yàn)證了核糖體蛋白在睪丸切片的定位，發(fā)現(xiàn)其與自噬底物p62一樣，在精子延伸階段核糖體蛋白的熒光累積。
 

圖3：A-C.蛋白組學(xué)結(jié)果分析；D.驗(yàn)證核糖體蛋白在ARMC3^-/-小鼠增加；E.在ARMC3^-/-小鼠睪丸切片觀察核糖體蛋白的定位。

總結(jié)
這項(xiàng)研究工作發(fā)現(xiàn)酵母蛋白Vac8將自噬體脂質(zhì)PtdIns3P的催化激酶復(fù)合體PIK3C3-C1募集到自噬體組裝位點(diǎn)來介導(dǎo)自噬起始。Vac8的小鼠同源分子ARMC3的自噬功能是保守的。缺乏 ARMC3的小鼠具有正常的生存能力但表現(xiàn)出完全的雄性不育。蛋白質(zhì)組學(xué)分析以及多種生化分析表明在缺乏ARMC3的精子細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)核糖體的自噬降解被阻斷，導(dǎo)致線粒體能量水平低和精子鞭毛運(yùn)動(dòng)力喪失，從而導(dǎo)致雄性小鼠完全不育。

這項(xiàng)研究表明，在多細(xì)胞生物中，在某些情況下，特別是當(dāng)細(xì)胞突然需要增加新陳代謝時(shí)，自噬被激活以降解胞內(nèi)物質(zhì)從而滿足細(xì)胞自主方式的物質(zhì)和能量需求。