共聚焦原理解析（四）：熒光壽命-一個(gè)適當(dāng)?shù)倪x擇

SP8 FALCON-即時(shí)產(chǎn)生熒光壽命成像（FLIM）
我們經(jīng)常聽到別人抱怨熒光壽命測量：“壽命分析太復(fù)雜了！”但這種情況即將改變！新技術(shù)和新概念的發(fā)展促進(jìn)了數(shù)據(jù)評(píng)估，意味著熒光壽命成像(FLIM)的速度提高了10倍，可以媲美標(biāo)準(zhǔn)共聚焦成像，且操作簡單。

圖為小鼠胚胎的壽命圖像。722個(gè)視野拼接，擬合出4個(gè)獨(dú)立的特征壽命。采集時(shí)間約1小時(shí)-傳統(tǒng)方法約1天。

熒光成像遠(yuǎn)超您的想象！
熒光過程提供了兩個(gè)用于成像的測量參數(shù)：強(qiáng)度和熒光壽命。熒光壽命是指分子停留在激發(fā)態(tài)的時(shí)間�？梢酝ㄟ^觀察足夠大量的激發(fā)-發(fā)射事件集合來測量熒光染料的典型壽命。我們可以測量圖像中所有像素的典型壽命，并將這些數(shù)字記入數(shù)組元素。那就是熒光壽命成像[1](FLIM，也稱為τ-映射）。典型的熒光壽命范圍在0.2到20納秒之間。

熒光壽命與熒光染料的濃度無關(guān)。無論樣品結(jié)構(gòu)僅有零星熒光染料還是載滿熒光染料：壽命信號(hào)始終相同，并表明在同一環(huán)境中存在相同的熒光染料。因此，熒光壽命不受光漂白的影響。樣品深處的圖像將比表面圖像暗得多——但壽命并沒有改變。這是壽命測定的主要優(yōu)勢(shì)。

如果分子環(huán)境刺激激發(fā)態(tài)衰變而不發(fā)射光子，則熒光強(qiáng)度會(huì)降低（淬滅）。熒光淬滅是一條單獨(dú)的發(fā)射路徑，因此在動(dòng)力學(xué)上與熒光過程形成競爭關(guān)系。激發(fā)態(tài)存儲(chǔ)現(xiàn)在可以通過一個(gè)以上的過程衰變，從而縮短熒光壽命。這種壽命的改變可用于收集分子環(huán)境的信息。

一種特殊類型的淬滅是將激發(fā)能量以非輻射的方式傳遞到相鄰的不同熒光染料中：“熒光共振能量轉(zhuǎn)移”[2]，F(xiàn)RET。此時(shí)，不僅第一個(gè)熒光染料（供體）變暗，壽命變短，而且第二個(gè)熒光染料（受體）在“錯(cuò)誤的”激發(fā)顏色下開始發(fā)光。由于這種效果的產(chǎn)生需要兩種熒光染料（小于10 nm）的密切接觸，因此將其用作研究分子相互作用的“分子標(biāo)尺”。它也是許多現(xiàn)代FRET生物傳感器的基礎(chǔ)，專門用于測量活體樣本中的各種細(xì)胞內(nèi)參數(shù)：Ca2+或其他離子濃度追蹤、酸堿度、極性和電位測量、蛋白質(zhì)相互作用等。

FLIM-標(biāo)準(zhǔn)
FLIM的黃金標(biāo)準(zhǔn)是“時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)”[3]TCSPC，它與多光子共聚焦顯微鏡兼容。用光脈沖照射樣本，測量發(fā)射光子到達(dá)的時(shí)間。為重建典型的壽命，這種測量要在同一樣本位置重復(fù)幾次。需要測量幾百個(gè)事件才能達(dá)到大約10%的準(zhǔn)確度。然后將數(shù)據(jù)按時(shí)間分組放入直方圖中。然后對(duì)該直方圖中隨時(shí)間出現(xiàn)的衰變進(jìn)行數(shù)學(xué)擬合，并直接提供所需的熒光壽命（圖01a-c）。


 
圖01a：測量激光脈沖激發(fā)（藍(lán)色箭頭）后發(fā)射光子（紅色箭頭）的到達(dá)時(shí)間tᵢ。此處繪制了5個(gè)測量值。

 
圖01b：到達(dá)時(shí)間的直方圖，包括上述示例中五個(gè)事件的集合。大多數(shù)計(jì)數(shù)#時(shí)間都很短。直方圖用指數(shù)衰減（紅色）來擬合。

 
圖01c：擬合顯示，例如，兩個(gè)單衰變（藍(lán)色和綠色曲線），衰變時(shí)間t₁和t₂，振幅為A₁和A₂。求和將再次獲得紅色衰變曲線。

這個(gè)過程是最精確的，并可以重復(fù)，但需要一定時(shí)間。測量后，系統(tǒng)在大約100納秒的死區(qū)時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)備好進(jìn)行下一次發(fā)射。要錄入400個(gè)事件，測量一個(gè)像素的時(shí)間達(dá)40微秒。一張512x512的圖像大約需要12秒，這無法適應(yīng)快速變化和移動(dòng)的生命系統(tǒng)。

目前的解決方案需要一定的技術(shù)靈活性、復(fù)雜的手動(dòng)數(shù)據(jù)處理和精密的評(píng)價(jià)程序。

新標(biāo)準(zhǔn)
徠卡顯微系統(tǒng)推出了一款新型FLIM顯微鏡：SP8 FALCON（FAst Lifetime CONtrast）熒光壽命成像系統(tǒng)可以解決以上所有問題。

本系統(tǒng)基于混合探測器（HyD）[4]，是理想的壽命成像傳感器，具有極短的死區(qū)時(shí)間。激光脈沖序列和發(fā)射光子脈沖都以高采樣率即刻實(shí)現(xiàn)數(shù)字化，將測得的距離直接輸入數(shù)據(jù)池。這些到達(dá)時(shí)間用于輸出“快速-FLIM”圖像。

新方法允許使用大多數(shù)激光脈沖，并應(yīng)用一個(gè)過濾器來限制只有一個(gè)光子發(fā)射的脈沖事件。在第一個(gè)光子到達(dá)后不久，隨即到達(dá)的光子不可避免的會(huì)被忽略，可以通過智能數(shù)學(xué)方法進(jìn)行校正�；�于以上種種因素，圖像記錄速度提高了10倍。

所有FALCON FLIM成像均集成在共聚焦顯微鏡中。記錄FLIM就像激活一個(gè)額外的通道。用于3D、時(shí)間和光譜系列的多維采集模式可立即用于FLIM成像。例如標(biāo)題圖像：具有經(jīng)典組織學(xué)染色的小鼠胚胎。使用NAVIGATOR軟件，創(chuàng)建了722個(gè)圖塊，每個(gè)圖塊為512x512像素的圖稿。原始圖像有1.9億像素。用四個(gè)指數(shù)對(duì)壽命進(jìn)行擬合，并以顏色進(jìn)行編碼。

應(yīng)用實(shí)例
在功能成像領(lǐng)域，我們希望監(jiān)測小分子、離子或電勢(shì)的動(dòng)態(tài)變化。這通常是用熒光探針完成的。其中多數(shù)顯示出強(qiáng)度和壽命的變化。也可以用熒光蛋白裝飾蛋白質(zhì)，并在活細(xì)胞中表達(dá)這些構(gòu)建體。該技術(shù)利用FRET跟蹤活細(xì)胞中的分子相互作用。最為現(xiàn)代化的工具是蛋白質(zhì)或肽，它們與所需的分析物（例如Ca2+）結(jié)合，并裝飾有一對(duì)進(jìn)行FRET的熒光蛋白。結(jié)合分析物后，肽將發(fā)生構(gòu)象變化，F(xiàn)RET將出現(xiàn)或消失。這些探針被稱為FRET-生物傳感器。生物傳感器的一種是利用cAMP結(jié)合蛋白Epac[5]

 
圖02：用游離態(tài)的cAMP刺激培養(yǎng)細(xì)胞，并用Epac FRET-生物傳感器進(jìn)行監(jiān)測。在紅色圓圈區(qū)域分析信號(hào)（平均到達(dá)時(shí)間tₐ）。隨時(shí)間變化的圖示見底部。由K.Jalink，B.van den Broek，NKI Amsterdam(NL)提供。

SP8 FALCON的新技術(shù)速度夠快，可以在活細(xì)胞中使用化學(xué)傳感器和FRET生物傳感器進(jìn)行熒光壽命成像。

無染色應(yīng)用是分析活體材料中的內(nèi)源性熒光。例如：癌細(xì)胞抑制細(xì)胞呼吸，傾向于無氧糖酵解(瓦博格效應(yīng))，這會(huì)導(dǎo)致積累更高濃度的熒光NADH_[6]。即使沒有活檢，多光子顯微鏡也能在皮膚組織中進(jìn)行深度成像。同樣，壽命對(duì)比度要可靠得多，因?yàn)樯顚拥娘@微鏡會(huì)受到吸收和陰影效應(yīng)的影響，從而使強(qiáng)度信號(hào)失真。

傳統(tǒng)意義上，不同的熒光染料以其不同的顏色來區(qū)分。如果激發(fā)和發(fā)射相同，仍然可以通過壽命進(jìn)行區(qū)分。發(fā)射強(qiáng)度和壽命可以作為顏色的函數(shù)獨(dú)立記錄。因此，可見熒光染料的數(shù)量是發(fā)射光譜和擬合壽命的乘積。

 
圖03：lt-染料分離的原理證據(jù)（6個(gè)信號(hào)）。用480 nm激發(fā)云杉葉的新鮮切片，在兩個(gè)通道（頂部和底部行）中進(jìn)行記錄，每個(gè)通道可分開顯示三個(gè)壽命（從左到右）。由Leica Microsystems的I.Steinmetz提供支持。

總結(jié)
徠卡顯微系統(tǒng)的SP8 FALCON（FAst Lifetime CONtrast）共聚焦和多光子顯微鏡匯集了所有這些新技術(shù)和新概念，生成FLIM技術(shù)，適用于多個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域。相較于傳統(tǒng)的TSCPS方法（時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)），圖像采集速度快了10倍，是迄今為止壽命成像的黃金標(biāo)準(zhǔn)。從而可以使用壽命對(duì)比來監(jiān)測活體樣本的運(yùn)動(dòng)學(xué)和動(dòng)力學(xué)情況。

其直接實(shí)現(xiàn)和自動(dòng)化使研究人員不再需要耗時(shí)于硬件調(diào)整和數(shù)據(jù)評(píng)估。3D堆疊、延時(shí)序列、鑲嵌掃描和激發(fā)或發(fā)射波長掃描等復(fù)雜的數(shù)據(jù)采集模式與FLIM技術(shù)無縫結(jié)合。


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