血流擾動導致血管內(nèi)皮損傷的產(chǎn)生新機制及保護內(nèi)皮的小分子化合物

動脈粥樣硬化的病灶性質(zhì)表明局部血流動力學微環(huán)境在動脈粥樣硬化中的關(guān)鍵作用。在動脈分支和彎曲處具有低而往復的剪切應力（振蕩剪切，OS）的擾動上調(diào)血管內(nèi)皮細胞 (EC) 中的促炎分子，從而誘導吸引循環(huán)單核細胞黏附、浸潤入動脈壁，平滑肌細胞活化、遷移至內(nèi)皮下，啟動動脈粥樣硬化發(fā)生。相比之下，在大動脈長直部具有高且單向剪切應力（脈沖剪切，PS）的規(guī)則層流對血管系統(tǒng)具有抗炎和動脈粥樣硬化保護作用。

在出現(xiàn)任何功能性結(jié)果之前，ECs 中由擾流與層流引起的不同基因表達模式和表型就會出現(xiàn)，并且它們被認為是動脈粥樣硬化或抗動脈粥樣硬化得內(nèi)皮細胞標志。系統(tǒng)地了解內(nèi)皮細胞致動脈粥樣硬化表型、基因表達和藥物作用之間的功能聯(lián)系，有助于有效地篩選抗動脈粥樣硬化藥物。

脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶-1/氧化還原因子-1（人類的 APEX1 和小鼠的 Apex1），能夠在 DNA 的無嘌呤/無嘧啶位點切割并激活許多轉(zhuǎn)錄因子的 DNA 結(jié)合活性，與血管 EC 功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。然而，APEX1 是否在內(nèi)皮表型的血流動力學調(diào)節(jié)中起作用仍有待確定�，F(xiàn)有證據(jù)表明，APEX1 在內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)中起著復雜的作用。盡管它很重要，但人們對 APEX1 在擾動流誘導的內(nèi)皮炎癥和動脈粥樣硬化中的確切作用知之甚少。

基于此，北京大學基礎(chǔ)醫(yī)學院周菁課題組在《美國國家科學院院刊》發(fā)表了相關(guān)研究成果。通過使用基于 CMap 的計算系統(tǒng)生物學方法來搜索可產(chǎn)生與 PS 與 OS 誘導的基因特征相似的化合物，最終確定了牡荊素（vitexin），一種從山楂葉中分離的天然黃酮類化合物，它可以大大降低內(nèi)皮細胞的促炎反應。該研究指出了脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶-1 (APEX1/Ref-1) 作為流體剪切力響應分子在血流擾動誘導的內(nèi)皮細胞炎癥反應及動脈粥樣硬化發(fā)生中具有重要作用。
 

人臍靜脈 ECs (HUVECs) 在四個時間段內(nèi)經(jīng)受 PS (12 ± 4 dyn/cm 2 , 1 Hz) 或 OS (0.5 ± 4 dyn/cm 2 , 1 Hz) （1、4、12 和 24 小時）。使用 CMap 數(shù)據(jù)庫分析剪切 24h 后細胞的測序數(shù)據(jù)，分析基因表達的相似程度，在 7056 個處理結(jié)果中尋找可以模擬 PS 與 OS 效應的生物活性化合物。

首先，該研究通過使用具有 EC-特異性 Apex1 缺失和管腔內(nèi) APEX1 過表達的小鼠，支持內(nèi)皮細胞 Apex1 在血管內(nèi)皮功能的流量調(diào)節(jié)中發(fā)揮促動脈粥樣硬化作用而非抗動脈粥樣硬化作用的觀點。研究人員發(fā)現(xiàn) APEX1 在擾動流下具有促進血管內(nèi)皮動脈粥樣硬化表型的作用。從機制上講，研究發(fā)現(xiàn) OS 誘導的促炎分子（SELE、VCAM1 和 ICAM1）的表達是由 APEX1 通過 NF-κB 通路介導的。這表明 APEX1 介導的內(nèi)皮細胞炎癥和功能障礙是受干擾的血流刺激的動脈粥樣硬化性內(nèi)皮細胞中重要的病理生理特征和機制。

通過使用基于 CMap 的藥物篩選和表達譜，實驗證明了牡荊素對剪切敏感基因表達的影響。隨后的研究表明，牡荊素減輕內(nèi)皮細胞對 OS 和促炎細胞因子 TNF-α 的促炎反應。此外，牡荊素的體內(nèi)給藥減弱了受擾流誘導的新內(nèi)膜形成和動脈粥樣硬化。有報道稱，牡荊素可抑制 ECs 中促炎細胞因子和 ROS 的產(chǎn)生，以及牡荊素在防止心肌功能障礙包括心肌肥厚、心肌梗塞和缺血/再灌注損傷中的應用，但這些研究沒有確定牡荊素直接靶向的分子，也沒有確定其在內(nèi)皮細胞中的綜合機制途徑。因此該研究在報告牡荊素的抗動脈粥樣硬化作用方面是獨一無二的。

此外，研究結(jié)果通過利用靶標參與測定 (CETSA) 結(jié)合生物物理表征 (SPR) 將牡荊素鑒定為 ECs 中 APEX1 的直接抑制劑。使用 CETSA，發(fā)現(xiàn)添加牡荊素可以穩(wěn)定 APEX1 的熱誘導聚集。應用 SPR 測定法對牡荊素與 APEX1 的相互作用進行動力學分析。SPR 方法還用于驗證已建立的 APEX1 抑制化合物 E3330 的作用，結(jié)果證明 E3330 與 APEX1 之間存在相互作用。藥理表征將牡荊素的內(nèi)皮保護活性與 APEX1 的促炎作用聯(lián)系起來，從而為牡荊素在動脈粥樣硬化抗炎治療中的應用提供了理論基礎(chǔ)。

該研究的另一個主要發(fā)現(xiàn)是證明 OS 和 TNF-α 誘導 APEX1 的核易位，這種誘導很可能是通過增強乙酰轉(zhuǎn)移酶 p300 與 APEX1 的結(jié)合而導致其乙�；�。

實驗表明，牡荊素可能會破壞 p300 和 APEX1 之間的關(guān)聯(lián)，以及隨后的乙�；�和核易位。值得注意的是，已經(jīng)在肺成纖維細胞和肺腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)了乙�；� APEX1 的專屬核積聚。在腎細胞中，用組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素 A 處理導致 APEX1 的核易位至細胞質(zhì)。

盡管 ECs 中剪切應力的機械轉(zhuǎn)導仍未完全了解，但 p300 被證明是一種機械敏感蛋白，因為 ECs 中已顯示其磷酸化或乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的剪切調(diào)節(jié)變化。該研究通過表明 OS（與 PS 相比）提高 p300 磷酸化水平并促進其與 ECs 中的 APEX1 的結(jié)合，解決了 p300 是否以及如何響應不同剪切模式的問題。然而，OS 也有可能通過不依賴 p300 的途徑促進 APEX1 乙�；�，因為已經(jīng)發(fā)現(xiàn) APEX1 和 HDAC1 之間的直接相互作用。

總之，該結(jié)果表明，牡荊素對內(nèi)皮細胞 APEX1 的抑制是一種抗炎療法，其靶向受干擾的血流誘導的動脈粥樣硬化 EC 表型和相關(guān)的動脈粥樣硬化形成。研究人員提出了一種機制，即擾動剪切應力促進 p300 的磷酸化以誘導其與 APEX1 結(jié)合導致 APEX1 乙酰化，并且乙�；�的 APEX1 與 p50 和 p65 NF-κB 形成復合物，易位到細胞核中，并促進 NF -κB 信號激活促炎分子的表達。這種機制表明 APEX1 在通過血流動力學調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能/功能障礙方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

該實驗已經(jīng)證明了牡荊素對血管系統(tǒng)的抗炎作用，并將 APEX-1 確定為它在 EC 內(nèi)的直接靶向分子之一。進一步研究發(fā)現(xiàn)牡荊素的多個潛在直接靶點和 APEX1 下游的功能通路，可能會提供有價值的藥理學認識，并驗證牡荊素作為一種預防動脈硬化性心血管疾病的藥物。

參考文獻：Zhao CR, Yang FF, Cui Q, Wang D, Zhou Y, Li YS, Zhang YP, Tang RZ, Yao WJ, Wang X, Pang W, Zhao JN, Jiang ZT, Zhu JJ, Chien S, Zhou J. Vitexin inhibits APEX1 to counteract the flow-induced endothelial inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Nov 30;118(48):e2115158118. doi: 10.1073/pnas.2115158118. PMID: 34810252.

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