歸納總結(jié)WB實驗過程中的各種問題和解決方法

前言
Western Blot 蛋白質(zhì)免疫印跡法（簡稱：WB），是基于蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳分離和特異性抗體識別蛋白的特性，通過顯色達(dá)到檢測目標(biāo)蛋白的一種技術(shù)。Western blot 近年來發(fā)展迅速，成為了蛋白研究方向的一種主要技術(shù)，但由于其實驗步驟和關(guān)鍵點多，耗時長，每個步驟可能都會影響最終結(jié)果，所以實驗中也會遇到各種問題，導(dǎo)致最終的結(jié)果“五花八門”，也讓眾多“新手”抓狂！

關(guān)于WB實驗的常見問題，有過不少網(wǎng)絡(luò)文獻(xiàn)做過總結(jié)和分析，本文將結(jié)合前人的經(jīng)驗對常見的問題進(jìn)行歸納，給出解決方法，建議收藏！

Western Blot 實驗流程
首先讓我們溫故而知新，回顧一下WB的實驗流程（如圖一所示）
Western Blot免疫印跡雜交試驗步驟多，包含多個影響實驗結(jié)果因素，如 SDS-PAGE 膠濃度、轉(zhuǎn)膜緩沖液、封閉液、一抗抗體及其特異性，二抗孵育及漂洗等。

常見問題
本文將現(xiàn)象總結(jié)歸納為以下五類，分析問題的原因，并為大家提供可參考的解決方法。
1. 膜上無信號或無目標(biāo)條帶  

問題	可能的原因	建議
操作問題	洗膜過度	洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多，減少洗膜次數(shù)，洗膜時間和溫度
	蛋白未轉(zhuǎn)到膜上	轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用總蛋白染色劑染膠來確定轉(zhuǎn)膜效率；轉(zhuǎn)膜過程中膠與膜完全接觸；轉(zhuǎn)印夾層排布正確；按照膜的制造商的使用說明潤濕膜；轉(zhuǎn)印部件在電印跡過程中未過熱；使用正對照和/或分子量 Marker；可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時間和電流優(yōu)化轉(zhuǎn)印時間和電流。
	蛋白未完全結(jié)合到膜上	低分子量的抗原可能會穿過轉(zhuǎn)印膜，需使用小孔徑的膜進(jìn)行。
	過度封閉	減少封閉時間，試用不同的封閉液
	底物孵育時間太短	延長底物孵育的時間。
抗體問題	一抗、二抗不匹配	選擇與一抗相匹配的二抗類型，二抗需和一抗宿主的物種相同�？赏ㄟ^設(shè)置內(nèi)參可以驗證二級檢測系統(tǒng)的有效性。
	一抗失效	使用有效期內(nèi)的抗體，分裝保存，避免反復(fù)凍融取用，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。
	結(jié)合目標(biāo)蛋白的抗體不足	降低一抗稀釋度;使用效價高的一抗；延長抗體孵育時間;膜充分浸潤在液體中。
	一抗或/二抗?jié)舛鹊?/td>	增加抗體濃度；
	一抗或/二抗?jié)舛忍��?/td>	使用太多一抗或二抗可能導(dǎo)致底物迅速耗竭，呈現(xiàn)出很弱的信號
抗原問題	一抗不識別目標(biāo)蛋白	參照數(shù)據(jù)庫對比抗原序列和蛋白序列，選擇合適的一抗
	抗原不足或降解	每條泳道上樣量不低于 20~30 ug, 使用蛋白酶抑制劑并設(shè)置陽性對照。
		封閉底物可能含有蛋白水解酶活性（如明膠）
緩沖液問題	封閉液與一抗或二抗有交叉反應(yīng)	更換適合的封閉液
	緩沖液中含有疊氮鈉	疊氮鈉是一種 HRP 的抑制劑，緩沖液不能使用疊氮鈉作為防腐劑。
	ECL發(fā)光液失活或靈敏度不夠	更換發(fā)光液，選擇超敏發(fā)光液
	曝光時間不足	延長曝光時間

2. 目標(biāo)條帶信號弱 WB結(jié)果中可能出現(xiàn)有目標(biāo)蛋白條帶，但是目標(biāo)條帶在膜上顏色較淺，原因和解決建議如下：

問題	可能的原因	建議
操作問題	轉(zhuǎn)膜不充分	規(guī)范轉(zhuǎn)膜的操作；優(yōu)化電轉(zhuǎn)條件；可將兩張膜疊加在一起，防止轉(zhuǎn)膜過度，或使用小孔徑膜
	洗膜過度	洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多，減少洗膜次數(shù)，洗膜時間和溫度
	封閉過度	減少封閉時間，試用不同的封閉液
	曝光時間過短	延長曝光時間，如使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，可調(diào)整顯示灰度值
	抗體染色不充分	延長孵育時間或增加抗體濃度
抗體問題	抗體濃度低	增加抗體濃度
	抗體和抗原親和力不足	增加抗體濃度
	抗體活性不足	使用有效期內(nèi)的抗體，分裝保存，避免反復(fù)凍融取用，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。
抗原問題	抗原量不足	增加上樣量
緩沖液問題	緩沖液中含有疊氮鈉	疊氮鈉是一種 HRP 的抑制劑，緩沖液不能使用疊氮鈉作為防腐劑。

3. 圖像高背景
3.1 均一性的高背景

問題	可能原因	建議
操作問題	封閉溫度過高，封閉不完全	封閉液的選擇與優(yōu)化；使用5%脫脂奶粉封閉；優(yōu)化封閉時間和溫度
	膜的問題	防止膜過程中干燥；換用NC膜進(jìn)行實驗；使用干凈鑷子并戴手套操作
	孵育中洗膜不充分	適當(dāng)增加洗膜時間和次數(shù)；確保在充分震蕩的條件下孵育膜，并且抗體充分覆蓋膜表面
	曝光過度	縮短曝光時間，或等待數(shù)分鐘后使用成像儀拍攝
抗體問題	一抗，二抗?jié)舛容^高	提高一抗，二抗稀釋度，優(yōu)化稀釋條件
	一抗，二抗和封閉液結(jié)合	更換封閉液；更換二抗或降低二抗?jié)舛?/td>
	儲存時間較長或儲存條件不當(dāng)導(dǎo)致抗體失活	選擇新的抗體
抗原問題	緩沖液中去污劑不夠	增加TBST中Tween 20的濃度
緩沖液問題	轉(zhuǎn)膜液，封閉液等不新鮮或被污染	現(xiàn)用現(xiàn)配

3.2 非均一性高背景

問題	可能的原因	建議
操作相關(guān)	封閉溫度過高，封閉不完全	封閉液的選擇與優(yōu)化；增加封閉液中蛋白濃度；優(yōu)化封閉時間和溫度
	膜沒有正確潤濕，也可能干過	使用干凈鑷子并戴手套操作；使用足夠液體，膜始終保持濕潤；孵育時使用脫色搖床；避免膜重疊，相互覆蓋
抗體問題	抗體濃度太高	提高一抗，二抗稀釋度，優(yōu)化稀釋條件
	二抗聚集	使用前過濾二抗或者更換二抗
	封閉劑中有聚集體	使用前過濾封閉劑或者更換
	一抗，二抗和封閉液結(jié)合	更換封閉液, 或更換二抗或降低二抗?jié)舛?/td>
緩沖液問題	儀器或用具被污染	保證儀器和用具干凈；確保膜上無殘留膠
	轉(zhuǎn)膜液，封閉液等不新鮮或被污染	使用干凈、新鮮的轉(zhuǎn)膜液，封閉液。建議現(xiàn)用現(xiàn)配

4. 非特異性條帶多

可能原因	建議
抗體與蛋白非特異性結(jié)合	更換抗體
抗體濃度太高	降低上樣量；提高一抗稀釋度。
抗體未純化	使用單克隆或親和層析純化后的抗體，減少非特異條帶
轉(zhuǎn)膜強(qiáng)度太強(qiáng)，導(dǎo)致雜帶太強(qiáng)	降低轉(zhuǎn)膜強(qiáng)度（時間和電流），使目標(biāo)蛋白上方的蛋白少轉(zhuǎn)移到膜上。
封閉不完全	增加封閉液中蛋白濃度
細(xì)胞傳代次數(shù)過多，導(dǎo)致其蛋白表達(dá)模式分化	使用原代或者傳代少的細(xì)胞株，和現(xiàn)在的細(xì)胞株一起做參照
新蛋白或同族蛋白分享同種表位的不同剪接方式	查其文獻(xiàn)報導(dǎo)，使用說明書報導(dǎo)的細(xì)胞株或組織

5. 條帶形狀異常
5.1 啞鈴狀條帶 該現(xiàn)象可能有兩個原因?qū)е�。一是由于配置膠有問題，膠凝固后不均一，可通過重新配置膠，確保膠質(zhì)量無問題。二是樣品可能含有過多雜質(zhì)，我們在樣品使用前對其進(jìn)行離心，以去除過多雜質(zhì)。

5.2 條帶發(fā)白 該現(xiàn)象可能原因是一抗?jié)舛冗^高，二抗上HRP催化活力太強(qiáng)，同時顯色底物處于臨界點，反應(yīng)時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白�？山档鸵豢购投�抗?jié)舛龋�或者更換底物。

5.3 條帶拖尾 該現(xiàn)象主要原因是蛋白量太大，或一抗?jié)舛群蜁r間太長，可根據(jù)情況調(diào)整蛋白量，同時一抗?jié)舛群蜁r間也可以縮短。

5.4 條帶相連 出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是上樣量太大或是制膠問題，分離膠和濃縮膠之間有間隙，樣品竄孔�？赏ㄟ^減少上樣量和提高配膠質(zhì)量來避免該問題。

5.5 條帶呈現(xiàn)微笑狀 電泳條帶或整體出現(xiàn) “︶ ”形狀，可能原因主要為：電泳速度過快，可通過減少電壓等減慢電泳速度；或是電泳溫度過高，使得膠變形，可在冷室或者冰浴中進(jìn)行電泳或者改變電泳pH。

5.6 條帶中出現(xiàn)邊緣規(guī)則的白圈 該現(xiàn)象很大可能是電轉(zhuǎn)中膜和膠之間存在氣泡，建議在轉(zhuǎn)膜前去掉膜和膠之間的氣泡。

總結(jié)一下

Western blot 技術(shù)目前是蛋白研究中最常用的方法之一，但也因為其步驟繁雜讓結(jié)果變幻莫測。但只要規(guī)范實驗流程，選用適合的試劑耗材和穩(wěn)定的成像系統(tǒng)，相信大家都會做出“美麗”的條帶。

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