Ficoll密度梯度離心法提取PBMC原理及注意事項

外周血單個核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有單個核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞（Lymphocyte）、單核細(xì)胞（Monocyte）、樹突狀細(xì)胞（DC）和其他少量細(xì)胞。PBMC可通過健康人或動物供體的外周血，通過Ficoll密度梯度離心法（IPHASE/匯智和源），磁珠分選等步驟獲得。

Ficoll是蔗糖的多聚體，中性，平均分子量400,000，當(dāng)密度為1.2g/mL，未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單個核細(xì)胞。  
人PBMC中不同細(xì)胞類型的比例

PBMC中大部分都是淋巴細(xì)胞，包括B細(xì)胞和T細(xì)胞，其中CD3 T細(xì)胞又占了淋巴細(xì)胞中絕大部分(45-70%)。這些T細(xì)胞都處于初始（naive）狀態(tài)，即已經(jīng)成熟了但沒有受到抗原刺激。 在正常人中，只有非常小的一部分初始T細(xì)胞會因抗原識別而被激活。同樣的B細(xì)胞也都處于初始狀態(tài)。相對于淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞的比例在10-30%，收到刺激之后會發(fā)育成樹突狀細(xì)胞(DC)或巨噬細(xì)胞。干細(xì)胞的比例非常低，只有0.1-0.2%，因此很難從全血樣本中分離到。  
一、外周血單個核細(xì)胞（PBMC）制備方法

1.設(shè)備與試劑
全血 （以10ml為例）
無菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理鹽水
蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS)
RPMI 1640培養(yǎng)基
胎牛血清（FBS）
雙抗P/S （Penicillin/ Streptomycin)
二甲亞砜（DMSO）
預(yù)先裝好異丙醇的凍存盒
 
2.方法/步驟
配制所需的溶液：
a. 細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 細(xì)胞凍存液：FBS中加入10%DMSO；

（1）將10ml全血轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加入10ml PBS溶液稀釋，輕輕混勻；
（2）取兩支15ml離心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后將稀釋的血液輕輕加到兩支離心管的ficoll上層，一定要輕柔，避免兩種溶液混合在一起，每只離心管各10ml稀釋血液；
（3）2,000rpm，20min，注意，降速設(shè)置中一定要設(shè)置成no break，或者只有1-2成的制動。離心完畢將得到如圖所示分層；
（4）PBMC所在細(xì)胞層為白色。此時可以用吸管將該層細(xì)胞吸取在另一干凈的15ml離心管中。
（5）加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min離心后去掉上清，再加入培養(yǎng)基進行相同操作的清洗；
（6）加入5-10ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進行后續(xù)計數(shù)培養(yǎng)或者鋪板；
（7）細(xì)胞凍存：將細(xì)胞離心收集之后，用細(xì)胞凍存液重懸。取1-1.5ml細(xì)胞至凍存管中，放入凍存盒（凍存盒可事先在4℃冰箱預(yù)冷）。再將凍存盒放置于-80℃冰箱過夜。第二天將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。  
IPHASE/匯智和源建議操作注意事項
（1）全血溶液可以加在Ficoll上層或者下層，但是最終都必須保證兩種溶液分層清晰。
（2）分離PBMC第一步離心的時候，一定不能設(shè)置或設(shè)置低水平的制動。否則將分層混亂。
（3）人PBMC和動物PBMC分離方法稍有不同，動物PBMC需求可聯(lián)系IPHASE/匯智和源。
 
細(xì)胞運輸與保存
（1）干冰運輸，收到細(xì)胞后立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復(fù)蘇；
（2）T25瓶運輸?shù)男迈r細(xì)胞，收到后應(yīng)繼續(xù)生長，傳代達到細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，再進行凍存，具體操作步驟見細(xì)胞培養(yǎng)步驟。
 
PBMC收到后注意事項
（1）收到PBMC細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時反饋。
（2）先不打開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放培養(yǎng)箱靜置四小時，穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，切忌在溫箱內(nèi)靜置過夜。
（3）靜置后鏡檢，拍照，記錄細(xì)胞狀態(tài)。建議傳代后也拍照記錄細(xì)胞生長情況。
（4）貼壁細(xì)胞：若細(xì)胞密度超過80%，可正常傳代；若未超過80%，收集細(xì)胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)基，留8ml繼續(xù)培養(yǎng)至80%左右再傳代，瓶蓋可稍微擰松。
（5）細(xì)胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)基含血清和雙抗，可收集后4℃保存?zhèn)溆茫�可補加2%血清。剛開始傳代時建議一半用細(xì)胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)基，一半用自備的培養(yǎng)基，使細(xì)胞逐漸適應(yīng)培養(yǎng)條件，以免因不適應(yīng)而造成生長狀態(tài)不佳。
（6）細(xì)胞胰酶消化液建議使用PBS配制。
 
IPHASE/匯智和源其他外周血單個核細(xì)胞：
人外周血單個核細(xì)胞 Human PBMC
猴外周血單個核細(xì)胞 Monkey PBMC
比格犬外周血單個核細(xì)胞 Dog PBMC
大鼠外周血單個核細(xì)胞 Rat PBMC
小鼠外周血單個核細(xì)胞 Mouse PBMC
兔外周血單個核細(xì)胞 Rabbit PBMC
豬外周血單個核細(xì)胞 Pig PBMC