人CD3+T淋巴細(xì)胞陽性分選原理及注意事項(xiàng)

細(xì)胞學(xué)研究中一個(gè)很重要的課題就是細(xì)胞的分離純化，尤其是需要對某種特定的細(xì)胞進(jìn)行功能研究，如對細(xì)胞培養(yǎng)上清液通過ELISA分析檢測細(xì)胞因子、細(xì)胞共培養(yǎng)檢測細(xì)胞功能等，都需要得到高純度的目的細(xì)胞。因此，高效地分離所需要的目的細(xì)胞是進(jìn)行細(xì)胞功能研究的先決條件。

細(xì)胞分選（cell sorting）是指根據(jù)細(xì)胞所具有的特性把某種特定的細(xì)胞亞群從混合的細(xì)胞樣品中分離出來的一種技術(shù)，它是對某一特定細(xì)胞進(jìn)行生化分析和功能分析的前提和基礎(chǔ)。常用的細(xì)胞分選方法主要有兩大類：一類是基于細(xì)胞物理性質(zhì)的密度梯度離心法（Density gradient centrifugation），另一類是基于免疫識(shí)別特性的方法，包括熒光激活細(xì)胞分選方法（Fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）和磁性激活細(xì)胞分選法（Magnetic-activated cell separation，MACS）。

密度梯度離心法是基于不同的細(xì)胞群之間存在沉降系數(shù)差異的原理建立起來的，在一定的離心力的作用下，不同種類的細(xì)胞會(huì)以各自不同的速度沉降，在密度梯度不同的區(qū)域上會(huì)形成區(qū)帶。這種方法簡單易行，但此種方法分離所得到的細(xì)胞純度較低，且細(xì)胞表面的標(biāo)志不明確，特異性較差，目前使用較少。

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是20世紀(jì)60年代后期發(fā)展起來的一種利用流式細(xì)胞儀（Flow cytometer）進(jìn)行快速定量分析細(xì)胞亞群的物理化學(xué)特性，根據(jù)這些物理化學(xué)特性精確分選細(xì)胞的新技術(shù)，F(xiàn)CM主要包括流式分析和流式分選兩部分。FACS最初于1972年提出，是指熒光驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞分選新技術(shù)，即利用分選型流式細(xì)胞儀分選標(biāo)記有熒光素偶聯(lián)抗體的細(xì)胞樣品，通過熒光系統(tǒng)區(qū)分目的細(xì)胞和非目的細(xì)胞。流式細(xì)胞儀通過接受激光照射后液流內(nèi)細(xì)胞的散射光信號(hào)和熒光信號(hào)反映細(xì)胞的物理化學(xué)特性，如細(xì)胞的大小、顆粒度以及抗原分子的表達(dá)情況等，目前已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究。流式細(xì)胞分選被認(rèn)為是細(xì)胞分選的“金標(biāo)準(zhǔn)”，它分選所得的細(xì)胞純度高、回收率高、且操作環(huán)境為全封閉型，不易被污染。但是，該方法所需設(shè)備比較昂貴，耗時(shí)，且需要高水平的技術(shù)支持以及專業(yè)的操作人員；且該方法在一段時(shí)間內(nèi)只能分選一個(gè)細(xì)胞樣品，若試驗(yàn)需要從不同的樣品中分選目的細(xì)胞時(shí)這種方法不可行；同時(shí)，由于FACS對細(xì)胞刺激較大，因此對分選出的細(xì)胞活性有較大影響。

磁性細(xì)胞分選（MACS）是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的，是用結(jié)合有抗體的免疫磁珠與樣品細(xì)胞進(jìn)行孵育，表達(dá)有相應(yīng)抗原的細(xì)胞就會(huì)特異性的結(jié)合在包被有抗體的免疫磁性微粒上，當(dāng)體系緩慢的經(jīng)過磁場時(shí)，帶有磁珠的細(xì)胞就會(huì)滯留在磁鐵上，而非目的細(xì)胞由于未結(jié)合磁珠仍存在與混合細(xì)胞懸液中，從而達(dá)到分離純化細(xì)胞的目的。MACS法是一種相對高效簡便的細(xì)胞分選方法，所需設(shè)備簡單，只需一塊專用磁鐵即可進(jìn)行分選，操作較為簡單，對操作人員的技術(shù)要求也不高，一般實(shí)驗(yàn)室都可進(jìn)行磁性分選。磁性分選只是讓細(xì)胞處于一個(gè)低磁場中，基本可以忽略對細(xì)胞的影響，分離得到的細(xì)胞具有較高的復(fù)蘇率及細(xì)胞活性，對于下游應(yīng)用影響較小，在保持細(xì)胞活性方面優(yōu)于流式分選。磁性分選因其高靈敏度、高純度、易操作、對目的細(xì)胞刺激較小等特性成為了細(xì)胞分選的首選方法，具有潛在的應(yīng)用前景。

二、免疫磁性細(xì)胞分選

2.1 原理

磁性細(xì)胞分選是基于免疫學(xué)中抗原抗體之間特異性結(jié)合的原理進(jìn)行的。以磁性微粒作為載體，對其進(jìn)行抗體或親和配體包被，形成免疫磁性復(fù)合微粒，當(dāng)其與混合細(xì)胞孵育后，磁性微粒表面抗體會(huì)與細(xì)胞表面的抗原決定簇發(fā)生抗原抗體的特異性反應(yīng)，使得細(xì)胞被磁性復(fù)合微粒標(biāo)記。在外加磁場的作用下，抗體與磁珠相連的細(xì)胞會(huì)因磁珠的磁性而滯留在磁場中，而不表達(dá)此抗原的細(xì)胞因不能與磁珠表面的特異性抗體結(jié)合而沒有磁性，不能夠在磁場中滯留，從而使目的細(xì)胞與非目的細(xì)胞分開，得到較高純度的目的細(xì)胞。
 

 

圖1 免疫磁性細(xì)胞分選原理示意圖
 

根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，可以將免疫磁性細(xì)胞分選系統(tǒng)分為不同種類。

2.2.1 依據(jù)所標(biāo)記細(xì)胞的不同分類

根據(jù)分選過程中所標(biāo)記細(xì)胞類型的不同將免疫磁性細(xì)胞分選系統(tǒng)分為陽性分選、陰性分選和復(fù)合分選。
陽性分選（IPHASE人CD3+T細(xì)胞陽性分選試劑盒），即將目的細(xì)胞亞群直接從細(xì)胞懸液中分離出來。通過磁珠包被目的細(xì)胞的特異性抗體與混合細(xì)胞懸液孵育，在抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合后，通過磁分離方式，將目的細(xì)胞分離出來。

陰性分選，即從多細(xì)胞懸液中分離去除非目的細(xì)胞而得到目的細(xì)胞的一種方法。此方法的優(yōu)點(diǎn)在于整個(gè)分選過程中目的細(xì)胞都未與磁珠（IPHASE SA磁珠）結(jié)合。由于抗原抗體的結(jié)合可能會(huì)引起細(xì)胞膜表面的信號(hào)傳遞，因此，此法具有較大的優(yōu)勢。但同時(shí)此方法也有不足之處，當(dāng)靶細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)所占細(xì)胞比例較小時(shí)，分選過程中存在的非特異性吸附會(huì)直接導(dǎo)致目的細(xì)胞的損失，此外，非目的細(xì)胞未被充分去除等，都會(huì)使得細(xì)胞的分選效率和分選純度較低。

復(fù)合分選是指聯(lián)合使用兩種以上的分選策略進(jìn)行分選，這種方法主要用于細(xì)胞亞群的分選或者想要分離得到高純度的稀有細(xì)胞。
 

根據(jù)分選方法的不同可以將免疫磁性細(xì)胞分選分為直接分選法和間接分選法。
直接分選法是指將抗體或者親和配體直接包被在磁性顆粒上，形成免疫磁性復(fù)合微粒，將其與多細(xì)胞懸液混合孵育之后，目的細(xì)胞會(huì)特異性的結(jié)合在免疫磁珠上，在外加磁場作用下，帶有磁珠的目的細(xì)胞會(huì)滯留在磁場中，而非目的細(xì)胞則會(huì)被去除。

間接分選法分選細(xì)胞引入了二抗，即將目的細(xì)胞首先與對應(yīng)的一抗孵育，激活細(xì)胞，之后清洗出去未結(jié)合的一抗，然后加入預(yù)先包被有二抗的磁性顆粒與活化后的細(xì)胞孵育，一抗與二抗之間的相互作用會(huì)導(dǎo)致磁粒結(jié)合在目的細(xì)胞上，同樣在磁場作用下滯留目的細(xì)胞，達(dá)到分選的目的。
 

免疫磁性細(xì)胞分選系統(tǒng)主要有磁性微粒、待標(biāo)記抗體、磁性分離器（磁力架）、緩沖體系等組成。其中，磁性微粒的選擇是分選成敗的關(guān)鍵。

磁性微粒是指具有磁性或超順磁性的粒子、磁性膠質(zhì)體、磁性脂質(zhì)體等。較為常見的磁性物質(zhì)為Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃磁性微粒；也有二氧化鉻和鐵素體的磁性微粒。應(yīng)用于細(xì)胞分選的磁粒（IPHASE SA磁珠）具有非常嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，其化學(xué)性質(zhì)必須穩(wěn)定，分散性好，在細(xì)胞懸液中不團(tuán)聚，去掉外加磁場后沒有磁滯現(xiàn)象，且不能吸附非特異性細(xì)胞，磁粒儲(chǔ)存過程中親和配體不能掉落，分選過程中可迅速、完全的被磁性分離，并可最大限度地減少細(xì)胞的吞噬作用。

磁性微粒的粒徑大小對于細(xì)胞分選具有很關(guān)鍵的作用，因?yàn)榱�徑直接決定了磁粒的物理性質(zhì)與可操作性。粒徑較大的磁粒（>1μm）和粒徑較小的磁粒（50~200nm）在細(xì)胞分選中都有廣泛的應(yīng)用。在某些情況下，不同的實(shí)驗(yàn)要求需要使用不同特性的磁粒。磁粒粒徑的大小與其標(biāo)記細(xì)胞的能力有很大關(guān)系，粒徑大的磁粒可以負(fù)載更多的標(biāo)記細(xì)胞接受部位。并且,細(xì)胞分選過程中，標(biāo)記了較大磁粒的細(xì)胞，更容易被磁性分離器吸附，對磁性分離器的要求較低，簡單、便宜、磁場強(qiáng)度較低的的磁分離器就可以滿足要求。標(biāo)記物或小分子標(biāo)記物標(biāo)記的粒徑小的磁粒，卻需要昂貴高強(qiáng)度的磁性分離器才能成功分選靶細(xì)胞。
 

磁性細(xì)胞分選過程分為磁性標(biāo)記及磁性分離兩個(gè)過程。從復(fù)雜樣品中分選靶細(xì)胞的流程大致分為三個(gè)步驟：
第一步，磁性標(biāo)記物與含有靶細(xì)胞的細(xì)胞懸液混合孵育。孵育過程中，靶細(xì)胞與標(biāo)記物相互作用，通過磁性分離把磁性標(biāo)記物-靶細(xì)胞偶聯(lián)產(chǎn)物與其它細(xì)胞分離。
第二步，清洗磁性標(biāo)記物-靶細(xì)胞復(fù)合物，去除雜質(zhì)。在這個(gè)過程中，可直接將磁性復(fù)合物-靶細(xì)胞復(fù)合物用來進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，也可以裂解細(xì)胞，通過色譜分析、電泳或等方法分析細(xì)胞內(nèi)容物。
第三步，磁性標(biāo)記物與靶細(xì)胞的分離、移除。將磁性標(biāo)記物與靶細(xì)胞分開，通過磁性分離去除磁性標(biāo)記物，釋放靶細(xì)胞，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。
 

作為細(xì)胞生物學(xué)研究的前提和基礎(chǔ)，細(xì)胞分選技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。隨著細(xì)胞分選技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫磁性細(xì)胞分選技術(shù)已越來越受到研究者的的認(rèn)可，目前已有許多商業(yè)化的試劑盒和分選磁珠（IPHASE SA磁珠）應(yīng)用于細(xì)胞亞群的分選。最常見的為從人的外周血中分離細(xì)胞亞群，如B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等。
 

細(xì)胞分選效果的評價(jià)指標(biāo)主要包括分選純度和分選得率。
分選純度是指被分選出所有細(xì)胞中目的細(xì)胞所占的百分比。
分選得率是指被分選出來的細(xì)胞數(shù)與原混合細(xì)胞懸液中該種目的細(xì)胞數(shù)的百分比。

三、人CD3+T淋巴細(xì)胞免疫磁性細(xì)胞分選

3.1 CD3+T淋巴細(xì)胞概述

免疫細(xì)胞（immune cell）是白細(xì)胞的俗稱，包括淋巴細(xì)胞和各種吞噬細(xì)胞等，也特指能識(shí)別抗原、產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞等，淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的基本成分。

淋巴細(xì)胞包括T淋巴細(xì)胞（CD3+）、B淋巴細(xì)胞（CD3-CD19+）、NK細(xì)胞（CD3-CD16+CD56+），其中T淋巴細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的主要組成。

T淋巴細(xì)胞是胸腺依賴淋巴細(xì)胞（thymus dependent lymphocyte），簡稱T細(xì)胞。CD3+T淋巴細(xì)胞代表全T淋巴細(xì)胞，包括輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CD3+CD4+）、抑制/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CD3+CD8+）、CD4+T細(xì)胞純真亞群（CD4+CD45RA+/ CD4+CD45RA+62L+）和記憶亞群（CD4+CD45RA-/ CD4+CD45RO+）、功能亞群（CD28+）、激活亞群（CD38+、HLA-DR+）、凋亡亞群（CD95+）等。

3.2人CD3+T淋巴細(xì)胞分選試劑盒簡介

IPHASE/匯智和源順應(yīng)市場需求，推出了可用于人CD3+T淋巴細(xì)胞分選的試劑盒，助力于生命科學(xué)的研究。根據(jù)分選樣品的不同，分為適用于人PBMC樣品分選和適用于人全血樣品分選的兩種試劑盒。試劑盒操作簡單便捷，各成分對細(xì)胞無毒性，且可實(shí)現(xiàn)高純度細(xì)胞分離的目的，為下游實(shí)驗(yàn)提供便捷。

3.3 試劑盒特點(diǎn)

l 便捷性 只需一步操作，即可實(shí)現(xiàn)高純度細(xì)胞分選。
l 高效性 分選得到目的細(xì)胞最短只需15min。
l 高純度 細(xì)胞分選純度可達(dá)95%以上。
l 高活性 細(xì)胞分選后目的細(xì)胞存活率高。
 

 

圖1為使用人CD3⁺T細(xì)胞陽性分選試劑盒分離人全血后，使用克隆號(hào)為HIT3a的人CD3-FITC流式抗體進(jìn)行染色后，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。左圖為未經(jīng)分選流式圖；右圖為經(jīng)陽性分選后的流式圖。
 
3.4試劑盒原理

采用免疫磁珠陽性分選的方法，利用偶聯(lián)于磁性微粒上人CD3單克隆抗體的高度特異性，使磁珠特異性結(jié)合PBMC（人外周血單個(gè)核細(xì)胞或臍帶血單個(gè)核細(xì)胞）中的CD3⁺ T細(xì)胞，通過外加磁場的作用，使得CD3⁺ T細(xì)胞得以滯留在磁場中而被分離出來。
 
4.3試劑盒組成
 

 
4.4 試劑盒分選流程