ACE2人源化小鼠助力新冠病毒研究
由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染引起的COVID-19大流行在全球范圍內已造成超過3.3億例感染。SARS-CoV-2刺突（Spike）蛋白在功能上不僅負責識別宿主細胞上的受體，同時還會介導細胞膜與病毒包膜融合，從而導致病毒感染宿主細胞。
目前全球流行的突變株在刺突蛋白上有多處突變發(fā)生，給疫苗的更新和設計都帶來了極大挑戰(zhàn)。SARS-CoV-2的 S蛋白單體包含兩個片段：氨基末端的S1亞基中包含一個受體結合域(RBD)，它能夠識別宿主ACE2受體并進行相互作用；而羧基末端S2亞基催化病毒和細胞膜的融合，推動之后病毒RNA釋放進入細胞，并在受感染細胞內進行復制的生物學過程，對病毒感染機制的研究是遏制當前大流行和預防未來冠狀病毒爆發(fā)的一個研究重點。雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)宿主血管緊張素轉換酶2（ACE2）蛋白能與病毒刺突蛋白結合，但結合后的分子機制還不明了。
北京時間2021年12月21號，發(fā)表在綜合性國際學術頂級期刊《PNAS》上的一項研究中，中國科學院上海巴斯德研究所孟廣勛組和Dimitri Lavillette組揭示了病毒感染過程中S2’片段的產(chǎn)生以及該片段在病毒和受體之間的識別、膜融合等過程中發(fā)揮的作用。
技術路線
病毒的刺突蛋白能和ACE2相結合。在這項新研究中，研究人員通過細胞-細胞融合技術以及敲入人ACE2的小鼠中分離出來的各種細胞系和原代細胞來研究ACE2蛋白對于感染過程的重要性以及刺突上關鍵氨基酸對于蛋白水解的必要性。他們發(fā)現(xiàn)在ACE2能促進病毒刺突水解產(chǎn)生S2’片段，這種關鍵性的水解作用對刺突介導的膜融合非常重要。
圖1. 本項研究中，作者通過體外細胞-細胞融合系統(tǒng)，分別在不同細胞中表達S蛋白、與有無ACE2受體的細胞共同培養(yǎng)，并且檢測了S蛋白在融合過程中的酶切反應、細胞膜融合與感染機制。
在ACE2蛋白存在的情況下，刺突驅動的合胞體形成會伴隨著S2’片段的形成
為了探究刺突 (S) 蛋白在活細胞中與其受體ACE2結合后的功能和生化特征，研究人員利用細胞-細胞融合試驗從合胞體中獲得可能切割的刺突蛋白產(chǎn)物。
通過將HEK293T-ACE2細胞和表達刺突的HEK293T細胞共培養(yǎng)再對合胞體進行裂解，以及免疫學實驗。研究人員檢測到了約68 kDa S2’的條帶 ，而對照組細胞只表達刺突蛋白并不存在S2’條帶。除此之外，S2’條帶的亮度還取決于加入的 ACE2 表達細胞的數(shù)量，表明ACE2的增加促進了刺突蛋白的蛋白水解加工。
圖2. ACE2蛋白介導的刺突驅動的合胞體的形成會伴隨S2’片段的形成。
S2’位點的切割需要功能性的ACE2蛋白特異性的識別作用
之前的研究已經(jīng)證明，鼠源表達ACE2的細胞對于野生型SARS-CoV-2刺突介導的感染具有抵抗性，因此，研究人員探究了人和小鼠ACE2變體產(chǎn)生的S2’片段是否具有相同的作用。
為了驗證這個假設，研究人員設計了Co-IP實驗驗證不同種屬ACE2蛋白的差異性。
研究人員發(fā)現(xiàn)，小鼠ACE2不能和刺突的RBD結構域結合，而人ACE2蛋白可以；不僅如此，人的ACE2蛋白能和全長的刺突互作，但是小鼠的蛋白無法互作。
研究人員為了在原代細胞中模擬刺突驅動的合胞體的形成，委托賽業(yè)生物構建了人源ACE2基因敲入小鼠（H11位點），并且分離得到了敲入小鼠肺上皮細胞。該品系小鼠攜帶“K18 promoter-Kozak-human ACE2 CDS-P2A-CreERT2-rBGpA”cassette，既表達人源的ACE2受體，又有CreERt2，可用于研究特定宿主基因（floxed）在應答新冠病毒感染中的作用。不僅如此，研究人員檢測到了S2’條帶，還觀察到了合胞體形成的綠色熒光信號。
圖3. 特異性的ACE2蛋白識別水解并產(chǎn)生S2’片段。
刺突815位精氨酸位點是S2’切割所必須的
已知SARS-CoV-2刺突蛋白可以在多個位置被切割，特別是S1/S2連接點(685)或S2’位點 (815) 處的精氨酸。研究人員為了研究其功能，研究人員將這兩個位置的精氨酸突變?yōu)楸彼帷?br />
實驗結果顯示，HEK293T細胞表達的包含R815A突變的刺突導致蛋白無法水解出S2’，因此刺突上的815位點的精氨酸是S2’水解所必須的。
圖4. 刺突蛋白第815位的精氨酸是水解產(chǎn)生S2’所必須的
小結
以上實驗證明了刺突蛋白參與病毒感染過程中，水解形成S2’蛋白的反應是新冠病毒感染過程中不可或缺的分子事件之一，其中的815位點的精氨酸更是水解切割所必須的。
