光纖記錄實(shí)驗(yàn)原理及實(shí)驗(yàn)步驟詳細(xì)記錄

一、光纖記錄工作原理

人類的大腦擁有約900億個(gè)神經(jīng)元，神經(jīng)元之間通過突觸相互連接形成了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并由此產(chǎn)生各種復(fù)雜的功能。大腦能夠合成和釋放上百種神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)信號(hào)通過突觸釋放的神經(jīng)遞質(zhì)從而在神經(jīng)元之間進(jìn)行傳遞（圖1）。

圖1
 

圖2

那么光纖記錄是如何檢測(cè)神經(jīng)活動(dòng)的呢？
以鈣離子熒光信號(hào)檢測(cè)為例，光纖記錄系統(tǒng)的技術(shù)原理是借助鈣離子濃度變化與神經(jīng)元活動(dòng)之間的嚴(yán)格對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用特殊的熒光染料或者蛋白質(zhì)熒光探針，將神經(jīng)元中鈣離子的濃度通過熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來，并被光纖記錄系統(tǒng)捕捉，從而達(dá)到檢測(cè)神經(jīng)元活動(dòng)的目的。

在神經(jīng)系統(tǒng)中，靜息狀態(tài)時(shí)神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度為50-100nM，而在神經(jīng)元興奮時(shí)胞內(nèi)鈣離子濃度能上升10-100倍，因此我們可以通過注射鈣離子基因編碼指示劑（Calcium indicator，如GCaMPs、RCaMPs等）來標(biāo)記鈣離子。鈣離子指示劑帶有熒光蛋白（如GFP、RFP等）及其變異體的蛋白質(zhì)，可與鈣調(diào)蛋白（CaM）和肌球蛋白輕鏈激酶M13域結(jié)合（圖3左）。當(dāng)神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)時(shí)鈣離子通道打開，大量鈣離子內(nèi)流并與CaM結(jié)合，導(dǎo)致M13和CaM結(jié)構(gòu)域相互作用，引發(fā)cpEGFP結(jié)構(gòu)重排，從而增強(qiáng)綠色熒光信號(hào)（圖3 右）。

因此我們可以通過檢測(cè)鈣信號(hào)的變化來表征神經(jīng)元的活動(dòng)，進(jìn)而研究神經(jīng)元活動(dòng)與動(dòng)物行為的相關(guān)性，探究復(fù)雜行為背后的調(diào)控機(jī)制。
 

圖3
 

(Marisela Morales, et al. Neuron, 2020)
圖4：VTA-VGluT2神經(jīng)元編碼先天逃避反應(yīng)
 

光纖記錄檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)的原理與上述方法相同，把cpEGFP嵌入特定的神經(jīng)遞質(zhì)受體，受體與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合后會(huì)引發(fā)受體構(gòu)象改變并發(fā)出熒光信號(hào)（圖5）。通過病毒注射、轉(zhuǎn)染等技術(shù)手段，可以將這種可遺傳編碼的探針表達(dá)在細(xì)胞或小鼠腦部，借助成像技術(shù)，觀察神經(jīng)遞質(zhì)濃度的實(shí)時(shí)變化。
 

圖5
 

(Yulong Li, et al. Cell, 2018)
圖6：條件反射實(shí)驗(yàn)中伏隔核Nac腦區(qū)的DA釋放
 

二、光纖記錄實(shí)驗(yàn)方法

在光纖記錄實(shí)驗(yàn)中，首先要選擇合適的熒光病毒。熒光染料或指示劑是通過病毒載體轉(zhuǎn)入目標(biāo)腦區(qū)，常用載體為AAV病毒。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同，需要選擇特異啟動(dòng)子或者Cre-FloxP系統(tǒng)來特異標(biāo)記目標(biāo)神經(jīng)元，無特異性的GCaMPs表達(dá)雖然可以觀測(cè)群體神經(jīng)元活動(dòng)但無神經(jīng)元特異性，光纖記錄的作用在于觀測(cè)特異類型神經(jīng)元群體的活動(dòng)。

實(shí)驗(yàn)流程：
1、在目標(biāo)腦區(qū)注射鈣熒光病毒，并在注射位點(diǎn)埋植光纖插針，用于收集熒光；

圖7：病毒注射與陶瓷插針埋植

2、待2-3周鈣熒光病毒表達(dá)后，連接光纖，使用光纖記錄系統(tǒng)采集動(dòng)物在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中大腦的鈣熒光信號(hào)；

圖8：病毒表達(dá)

3、通過分析軟件處理鈣熒光信號(hào)數(shù)據(jù)，并結(jié)合行為學(xué)視頻對(duì)動(dòng)物的行為進(jìn)行分析。

圖9：光纖記錄結(jié)合高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)
 

三、光纖記錄數(shù)據(jù)分析

以瑞沃德R820三色光纖記錄系統(tǒng)記錄的數(shù)據(jù)為例。
1、數(shù)據(jù)預(yù)處理。R820三色光纖記錄系統(tǒng)軟件集信號(hào)采集與數(shù)據(jù)分析于一體，在數(shù)據(jù)分析中，數(shù)據(jù)預(yù)處理過程包含平滑處理，基線矯正，運(yùn)動(dòng)矯正等功能。

平滑處理可以將數(shù)據(jù)中的過多雜信號(hào)去除，最大限度的突出目標(biāo)peak�；�線矯正多數(shù)針對(duì)的是熒光信號(hào)因長(zhǎng)時(shí)間記錄導(dǎo)致漂白信號(hào)逐步下降，或者光纖的自發(fā)熒光在長(zhǎng)期記錄下逐步被漂白基線逐步下降等情況。此情形的數(shù)據(jù)因?yàn)檎�體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，不利于后續(xù)數(shù)據(jù)作圖分析，所以需要進(jìn)行基線矯正。運(yùn)動(dòng)矯正用于采用410nm對(duì)照通道的數(shù)據(jù)，410nm數(shù)據(jù)可以用于反應(yīng)背景噪音信號(hào)，運(yùn)動(dòng)矯正即將410nm數(shù)據(jù)與470nm數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，通過算法從470數(shù)據(jù)中去除410nm數(shù)據(jù)的波動(dòng)，得到真實(shí)的熒光數(shù)據(jù)。
 

圖10：光纖記錄數(shù)據(jù)預(yù)處理

2. 將熒光數(shù)據(jù)與動(dòng)物行為數(shù)據(jù)同步對(duì)比，選擇事件標(biāo)記或者增加事件標(biāo)記，事件相關(guān)信號(hào)分析作圖。
 

圖11：事件分析

3. 將不同組的數(shù)據(jù)進(jìn)行組間對(duì)比，即可分析不同處理因素下熒光數(shù)據(jù)的差異。此外，還可結(jié)合行為學(xué)視頻同步分析動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)軌跡。
 

圖12：不同數(shù)據(jù)組間分析

通過以上步驟，原始的熒光數(shù)據(jù)就可以直接出圖啦。
光纖記錄實(shí)驗(yàn)的工作原理，實(shí)驗(yàn)方法以及數(shù)據(jù)分析已經(jīng)全部講完啦….