呼出氣冷凝液（EBC）采集與分析應(yīng)用研究
一、呼出氣冷凝液及其組成
呼吸是人體重要的生理過程，呼出氣的主要成分是水蒸氣，同時(shí)還含有二氧化碳等其他氣體和物質(zhì)。呼出氣冷凝液（Exhaled Breath Condensate，簡稱EBC）是在呼出氣采集裝置的輔助下，將呼出氣快速低溫（如-5℃）冷凝成的液體。
從來源看，呼出氣冷凝液（EBC）是在無創(chuàng)條件下獲得的下呼吸道襯液，推測認(rèn)為是呼吸氣流形成“氣旋”將氣道內(nèi)襯液“刮落”或是吸氣時(shí)氣道擴(kuò)張形成的張力將表層液相“撕裂”所致。EBC中大約含有0.1% 呼吸道襯里液滴和99%的水蒸氣，即1mL的EBC僅含有0.1μL呼吸道襯里液，因此，EBC是一種內(nèi)容物濃度極低的高度稀釋的基質(zhì)。從呼出氣冷凝液的組分來看，其組分十分復(fù)雜，包括多種無機(jī)氣體、揮發(fā)性有機(jī)化合物、低揮發(fā)性的有機(jī)分子，如醛類、脂肪酸和多肽等、過氧化氫（H2O2）、無機(jī)鹽類如硝酸鹽、生物大分子如蛋白質(zhì)與核酸，以及含有細(xì)菌、病毒和真菌的生物氣溶膠等等（見下表一）。
二、呼出氣冷凝液生物標(biāo)志物（biomarker）的研究和臨床應(yīng)用
在Medline（生物醫(yī)學(xué)）數(shù)據(jù)庫中搜索呼出氣冷凝液相關(guān)文獻(xiàn)，通過PubMed使用 “Exhaled breath condensate”關(guān)鍵詞可搜索到1705篇文獻(xiàn)（2001~2021年）；通過PubMed使用“Exhaled breath condensate and biomarker”兩個(gè)關(guān)鍵詞可搜索到相關(guān)文獻(xiàn)894篇（2001~2021年），可見人們對(duì)呼出氣冷凝液（EBC）的研究熱情一直非常高，且創(chuàng)新性論文增長迅速，幾乎涵蓋現(xiàn)代呼吸醫(yī)學(xué)的所有領(lǐng)域。
I.生物標(biāo)志物的研究
大量研究表明，呼出氣冷凝液中的多種生化物質(zhì)的濃度變化（或有無的變化）與呼吸系統(tǒng)的病理狀態(tài)密切相關(guān)，這些生化物質(zhì)被稱為潛在的生物標(biāo)志物（biomarkers），它們很有希望應(yīng)用于臨床診斷：科研工作者通過收集并分析含有生物標(biāo)志物的EBC樣本，從中發(fā)現(xiàn)各種生物標(biāo)志物與疾病之間的關(guān)系，進(jìn)而深入了解和洞悉疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和機(jī)理等，應(yīng)用于如肺癌的早期診斷和高危人群中的篩查；哮喘、慢性阻塞性肺疾�。–OPD）等呼吸道疾病的動(dòng)態(tài)監(jiān)測、療效驗(yàn)證和病情評(píng)估等方面。
與呼吸道炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的潛在的多種生物標(biāo)志物得到廣泛而充分的研究。如pH、過氧化氫，白三烯（LTs)，8-異前列腺素和細(xì)胞因子等生物標(biāo)志物。
pH代表呼吸道表面黏液的酸化程度，呼吸道的炎癥與氣道酸化即EBC-pH降低相關(guān)，如研究表明哮喘加重期、COPD 患者的EBC-pH較正常人低，支氣管哮喘的吸煙人群EBC-pH 降低。
過氧化氫（H2O2）是人體氧化應(yīng)激的標(biāo)志性產(chǎn)物之一。EBC-H2O2的水平與肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺疾�。–OPD）、肺纖維化等疾病的關(guān)系都有深入的研究。如研究發(fā)現(xiàn)：非吸煙者哮喘患者的EBC-H2O2水平顯著高于健康受試者，特別是成人哮喘患者的EBC-H2O2水平高于健康受試者，而哮喘患兒EBC-H2O2濃度與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，EBC-H2O2水平與哮喘的嚴(yán)重程度和控制狀態(tài)相關(guān)，所以過氧化氫有可能作為指導(dǎo)哮喘治療的生物標(biāo)志物。大量研究發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾�。–OPD）患者中EBC-H2O2也顯著升高，但急性COPD患者經(jīng)治療后EBC-H2O2降低。
白三烯（LTs）是白細(xì)胞產(chǎn)生的花生四烯酸（AA）經(jīng)5-脂氧合酶（5-LOX）途徑代謝產(chǎn)生的一組炎性介質(zhì)，包括白三烯B4(LTB4)、半胱氨�；兹�(CysLTs)等，其中白三烯B4(LTB4)是目前所知作用最強(qiáng)的粒細(xì)胞趨化因子，如在哮喘和COPD患者中能發(fā)現(xiàn)EBC-LTB4的升高。半胱氨�；兹�(CysLTs)具有誘導(dǎo)平滑肌收縮，增加血管通透性，刺激黏液分泌并減少黏膜纖毛清除率等作用，它們參與包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張等多種氣道炎癥性疾病的發(fā)病過程。前列腺素E2（PGE2）和8-異前列腺素也是花生四烯酸的衍生產(chǎn)物，PGE2有促炎作用和抑制支氣管收縮，EBC-PGE2水平的升高可能反映了哮喘患者的吸煙狀況。 8-異前列腺素是花生四烯酸被自由基氧化后生成的產(chǎn)物，被認(rèn)為是測定體內(nèi)氧化應(yīng)激的金指標(biāo)。在急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、急性肺損傷、哮喘和兒童呼吸道炎癥等多種肺部疾病中，研究發(fā)現(xiàn)EBC-8-isoPG水平都有顯著的升高。
細(xì)胞因子(cytokine，CK)是由多種組織細(xì)胞（主要為免疫細(xì)胞）所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，它們具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)、腫瘤消長等多種生物學(xué)功能。在EBC中發(fā)現(xiàn)了多種與哮喘，COPD及肺癌相關(guān)的細(xì)胞因子生物標(biāo)志物。如促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（ILs），其中IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10和IL-17在哮喘穩(wěn)定期表達(dá)升高；兒童哮喘人群中，EBC-IL-4水平升高，同時(shí)干擾素γ水平降低。腫瘤壞死因子TNF-α也是炎癥標(biāo)志物之一，在急性COPD,哮喘和肺癌患者中均發(fā)現(xiàn)EBC-TNF-α水平升高。
下表二中列舉了部分文獻(xiàn)報(bào)道的生物標(biāo)志物的研究成果。
應(yīng)該指出的是，近些年來，EBC蛋白質(zhì)組分析、基因組分析以及代謝組學(xué)分析的研究越來越多。EBC組學(xué)分析取得了很多令人印象深刻的研究結(jié)果。如對(duì)EBC的廣泛蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了與哮喘的病理生理機(jī)制相關(guān)的生物標(biāo)志物。在Bloemen 等人的研究中，哮喘兒童的EBC-細(xì)胞角蛋白1水平顯著高于健康對(duì)照組，而EBC-細(xì)胞角蛋白2、5、6、8、9、10、14和16、白蛋白、肌動(dòng)蛋白、血紅蛋白、溶菌酶、鈣顆粒蛋白B和結(jié)蛋白的濃度沒有顯著差異。在EBC基因組分析方面，如對(duì)肺癌患者的EBC基因組分析，檢測到p53基因的體細(xì)胞突變，而在健康對(duì)照組中未檢測到；對(duì)NSCLC患者的EBC分析發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星DNA不穩(wěn)定性和雜合性缺失：3p染色體(位點(diǎn)D3S2338、D3S1266、D3S1304、D3S1289)。對(duì)重度吸煙者和NSCLC患者中都發(fā)現(xiàn)了相同的微衛(wèi)星EBC-DNA變化。Eva Borras等人研究了流感感染者和流感疫苗接種者的呼出氣冷凝液的生物標(biāo)志物。通過液相色譜法結(jié)合四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（LC-qTOF）的檢測技術(shù)對(duì)呼出冷凝液（EBC）樣品進(jìn)行分析，使用靶向和非靶向方法分析所有代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，以檢測炎癥和氧化應(yīng)激生物標(biāo)記物中的特定已知生物標(biāo)記物，以及與特定感染相關(guān)的新分子。研究結(jié)果表明能夠找到流感疫苗接種前后采集的呼吸樣本之間的明顯差異，以及與炎癥過程和氧化應(yīng)激相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物等。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究甲型流感和其他病毒在人體系統(tǒng)中的作用提供了非常有希望的信息。Annalisa Campanella等則根據(jù)EBC肺癌候選生物標(biāo)記物的來源（基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組、代謝組、蛋白質(zhì)組和微生物群）將其進(jìn)行分類，證明EBC分析在癌癥診斷、分子分析、治療監(jiān)測和高危人群篩查中的潛在用途。
II.臨床應(yīng)用
分析廣泛應(yīng)用于肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、職業(yè)性肺損傷等肺部疾病的臨床研究，也有不少關(guān)于細(xì)菌或病毒性呼吸道感染，包括最近兩年來席卷全球的新冠病毒肺炎的研究報(bào)道。前面討論EBC的生物標(biāo)志物時(shí)能夠看到很多的EBC分析在肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺病等肺部疾病的臨床應(yīng)用的例子，在此不再贅述。
在EBC-細(xì)菌和病毒研究方面，如Yunhao Zheng等人使用商業(yè)化的EBC收集裝置(北京鼎藍(lán)BioScreenII)與LAMP（環(huán)介等溫?cái)U(kuò)增）方法相結(jié)合,研究呼吸道感染癥狀的受試者的EBC中可能存在的細(xì)菌性病原微生物。研究結(jié)果證明流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和MRSA，可以通過呼出的氣體從感染者中釋放出來,也證明了流感嗜血桿菌是導(dǎo)致常見呼吸道感染的主要病原體。研究表明EBC結(jié)合LAMP分析方案提供了一種可能的快速、有效、無創(chuàng)的感染病原體的診斷方法。
在新冠病毒肺炎的臨床應(yīng)用方面，在pubmed中輸入“Exhaled Breath Condensate，COVID-19”關(guān)鍵詞，可搜索到15篇相關(guān)文獻(xiàn)，這些研究為EBC分析在新冠肺炎的臨床診斷等方面做了初步而有益的探索。如Makoto Sawano等收集48名2019-冠狀病毒疾病患者的EBC樣本，并結(jié)合RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）技術(shù)（即RT-PCR）定量分析病毒的靶向E基因來確定病毒載量，對(duì)檢測率和病毒載量相對(duì)于患者特征和發(fā)病天數(shù)的變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)估，研究結(jié)果表明需要機(jī)械通氣與較高的病毒載量顯著相關(guān)（p<0.05）；需要吸氧或機(jī)械通氣、發(fā)病后少于3天、咳嗽或發(fā)熱與較高的檢出率顯著相關(guān)（p<0.05）。在自發(fā)呼吸患者中，EBC-病毒載量隨時(shí)間呈指數(shù)衰減。發(fā)病后第2天的檢出率為86%，此后惡化。在機(jī)械通氣患者中，無論發(fā)病后幾天，檢出率和病毒載量都很高。這些結(jié)果支持了對(duì)發(fā)病后2天內(nèi)的COVID-19患者使用RT-PCR技術(shù)檢測EBC-新冠病毒的可行性。
三、呼出氣冷凝液采集裝置與技術(shù)
I.呼出氣冷凝液采集裝置
目前臨床研究上絕大多數(shù)EBC收集裝置為商業(yè)化采集器，如R-Tube、EcoScreen、TURBO-DECCS、ANACON、BioscreenII等，適用范圍包括自主呼吸和機(jī)械通氣的患者。我們以呼出氣采集器BioscreenII為例來介紹呼出氣冷凝液的采集裝置及技術(shù)。
BioscreenII是北京鼎藍(lán)科技有限公司研發(fā)的呼出氣冷凝液采集器，是一款便攜且快速采集呼出氣冷凝液（Exhaled Breath Condensate, EBC）的裝置（見圖1左）。該采集裝置由采集器主機(jī)、電源適配器和一次性無菌采樣耗材（分離蓋、采集管和吹氣管）組成。（設(shè)備詳情請(qǐng)參考：http://www.dingbluetech.com/product/278199832）
BiscreenII的主要特點(diǎn)：（1） BioscreenII采用了先進(jìn)的半導(dǎo)體制冷元器件和電動(dòng)制冷方式，平均降溫速率為5℃/min；選用50ml離心管，加大冷凝接觸面積，進(jìn)一步加快冷凝速度，使呼出氣迅速液化形成冷凝液；（2）采集溫度為-5℃~0℃，出廠默認(rèn)-4℃，且能實(shí)時(shí)顯示冷凝溫度；（3）特有的分離蓋設(shè)計(jì)，使呼出氣在離心管內(nèi)形成旋風(fēng)氣流，推動(dòng)水霧形成液滴，減少液膜形成，同時(shí)可不斷吹落側(cè)壁冷凝液滴，匯集到冷凝管底部，提高了樣品收集率，采集效率為200μL/min，3～5分鐘就可采集0.5～1ml冷凝液；同時(shí)使采集者呼出的氣體與唾液有效分離；(4)該裝置外形尺寸為255*215*120mm，總重量2.0kg，輕巧便攜。
圖1 呼出氣采集器BioscreenII（左）和 呼出氣冷凝液的采集（右）
II.呼出氣冷凝液采集技術(shù)
與支氣管肺泡灌洗(BAL)等具有相對(duì)侵入性和挑戰(zhàn)性的技術(shù)方法相比，呼出氣冷凝液的采集無疑是一種先進(jìn)的無創(chuàng)、輕松、無痛的技術(shù)，只需要被采集者簡單地潮汐呼吸。
（1）采集原理
患者在平靜呼吸時(shí)將呼出氣吹進(jìn)低溫密閉采集裝置（見圖1右），同時(shí)裝置的冷凝系統(tǒng)使氣體凝結(jié)形成液滴并收集在采集管中，采集的樣品可進(jìn)一步低溫儲(chǔ)存或檢測分析。
（2）采集過程
采集前，被采集者應(yīng)該避免運(yùn)動(dòng)、抽煙或者進(jìn)食一些特殊的食物如咖啡因類飲料、碳酸飲料等，因?yàn)橛醒芯勘砻鞒闊熀吞厥獬煞值娘嬃蠒?huì)導(dǎo)致EBCD的某些生物標(biāo)志物濃度的變化；采集前先清水（或特定的溶液）漱口，休息十分鐘，保持呼吸平靜。當(dāng)采集器的準(zhǔn)備工作完畢，采集冷凝溫度降至-5℃時(shí)，被采集者對(duì)吹氣管均勻正常地吹氣：吹氣時(shí)保持用鼻吸氣，用嘴呼；盡量將肺部余氣吹出，有利于提高內(nèi)容物的檢出率。吹氣采集時(shí)間一般為3～5分鐘，采集結(jié)束后，立刻取出采集管進(jìn)行低溫儲(chǔ)存或用于檢測分析。
（3）注意事項(xiàng)
采集過程中需要特別注意的兩個(gè)問題：一是防止EBC樣品的污染，如在采集過程中防止采集管的污染，防止唾液、口腔和上呼吸道的內(nèi)容物等對(duì)EBC的污染等。二是采集的EBC樣品的維護(hù)，可根據(jù)檢測分析的需要采取合適的低溫（如-70℃）存儲(chǔ)以防止樣品中的生化物質(zhì)的降解變質(zhì)，必要時(shí)需將樣品分裝保存以防止EBC 樣品的反復(fù)凍融等。
（4）面臨的問題
各種不同品牌的商業(yè)化呼出氣冷凝液采集器被廣泛應(yīng)用于EBC的研究，但研究者也注意到一些問題：（1）環(huán)境條件的不同，采集器裝置和采集操作的不同，都可能導(dǎo)致采集到的呼出氣冷凝液“內(nèi)容物”有所不同。如有研究表明環(huán)境溫度和相對(duì)濕度對(duì)EBC-pH的變化有貢獻(xiàn)；EBC中的過氧化氫水平在48-140mL/s的呼氣流量下具有流量依賴性等。所以，對(duì)不同品牌收集器的呼出氣冷凝液進(jìn)行比較研究，對(duì)EBC收集操作進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化也是EBC研究面臨的課題之一。（2）另一個(gè)應(yīng)用的難題是EBC是一種含有大量水蒸氣的基質(zhì)，因此大多數(shù)生物標(biāo)志物被高度稀釋，接近較低的檢測靈敏度極限，有必要建立一個(gè)能夠反映氣道中各生物標(biāo)志物實(shí)際水平的EBC稀釋指標(biāo)，但目前還沒有金標(biāo)準(zhǔn)稀釋因子（gold standard dilution factor）被定義并廣泛用于研究。另外，從采集的角度來看，更有效地采集與富集裝置也有待研究，如研究發(fā)現(xiàn)：將呼出氣冷凝液（EBC）凍干再進(jìn)行檢測分析，則其生物標(biāo)志物的濃度可有效提高20倍。
四，總結(jié)與展望
EBC分析是一種有臨床應(yīng)用前景的肺功能指標(biāo)檢測新技術(shù)。一方面，呼出氣冷凝液(EBC)提供了一種新的診斷呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物的標(biāo)本，通過分析EBC的生物標(biāo)志物的變化，可提供下呼吸道和肺部可能的病理狀態(tài)的信號(hào)，用于疾病早期的診斷、篩查，監(jiān)測病情進(jìn)程與療效評(píng)估，也能為疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供諸多有用信息等。另一方面，呼出氣冷凝液收集設(shè)備具有便攜的特點(diǎn)，且收集不受年齡、性別、病情程度的影響與限制等，幾乎可以應(yīng)用于所有患者，包括小兒患者、機(jī)械通氣患者及昏迷患者等。因此，EBC分析作為一種完全無創(chuàng)、簡便快捷、應(yīng)用人群廣泛、可實(shí)現(xiàn)疾病動(dòng)態(tài)監(jiān)測等優(yōu)勢的新技術(shù)，受到眾多的醫(yī)學(xué)與科研工作者的重視與青睞。
目前EBC的研究還處于臨床應(yīng)用的初級(jí)階段，尚還存在著很多亟待解決的問題，其中最主要的問題是“標(biāo)準(zhǔn)化”的問題：如（1）呼出氣冷凝液作為一種如同血液，尿液的生化標(biāo)本，其組分十分復(fù)雜，尚無大規(guī)模人群的研究報(bào)道，缺乏各種生物標(biāo)志物在EBC中的正常參考值；（2）確定的正常人的呼出氣冷凝液的蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和基因組學(xué)“指紋”還沒有被發(fā)現(xiàn)和沒有被充分描述；（3）現(xiàn)有的知識(shí)（knowledge）基于小規(guī)模研究提供的數(shù)據(jù)，通常顯示出相互矛盾的結(jié)果，可能歸因于EBC生物標(biāo)記物的再現(xiàn)性差；（4）EBC的稀釋度在個(gè)體間存在著很大的差異，目前尚缺乏確定EBC稀釋度統(tǒng)一的方法，從而可能會(huì)影響對(duì)檢測結(jié)果的評(píng)估；（5）研究者所用的設(shè)備或收集及檢測方法技術(shù)不同，可能得出不同的結(jié)果，也使得結(jié)果之間缺乏可比性等等。
總而言之，EBC分析是生物醫(yī)學(xué)研究的一項(xiàng)有趣的成就，也是一項(xiàng)有希望成為肺部疾病及全身性疾病診斷的重要技術(shù)。特別是近些年來，隨著基因組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等生命學(xué)科的飛速發(fā)展，同時(shí)分子檢測分析技術(shù)也在高速發(fā)展，如高分辨質(zhì)譜分析技術(shù)，核酸擴(kuò)增-檢測技術(shù)，以及生物樣品處理與富集技術(shù)的突破與發(fā)展等，為EBC分析開拓了以蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子及細(xì)菌病毒微生物氣溶膠為生物標(biāo)志物的研究新視角和新領(lǐng)域。
主要參考文獻(xiàn)：
呼吸是人體重要的生理過程，呼出氣的主要成分是水蒸氣，同時(shí)還含有二氧化碳等其他氣體和物質(zhì)。呼出氣冷凝液（Exhaled Breath Condensate，簡稱EBC）是在呼出氣采集裝置的輔助下，將呼出氣快速低溫（如-5℃）冷凝成的液體。
從來源看，呼出氣冷凝液（EBC）是在無創(chuàng)條件下獲得的下呼吸道襯液，推測認(rèn)為是呼吸氣流形成“氣旋”將氣道內(nèi)襯液“刮落”或是吸氣時(shí)氣道擴(kuò)張形成的張力將表層液相“撕裂”所致。EBC中大約含有0.1% 呼吸道襯里液滴和99%的水蒸氣，即1mL的EBC僅含有0.1μL呼吸道襯里液，因此，EBC是一種內(nèi)容物濃度極低的高度稀釋的基質(zhì)。從呼出氣冷凝液的組分來看，其組分十分復(fù)雜，包括多種無機(jī)氣體、揮發(fā)性有機(jī)化合物、低揮發(fā)性的有機(jī)分子，如醛類、脂肪酸和多肽等、過氧化氫（H2O2）、無機(jī)鹽類如硝酸鹽、生物大分子如蛋白質(zhì)與核酸，以及含有細(xì)菌、病毒和真菌的生物氣溶膠等等（見下表一）。
表一 呼出氣及冷凝液主要組成成分
| 呼出氣及冷凝液分類 | 組分 |
| 呼出氣（37℃） | Water Vapor（水蒸氣）, CO2, O2, N2, NO, CO |
| 揮發(fā)性物質(zhì) | VOCs（有機(jī)物）, linear aldehydes（乙醛類）, ammonia（氨類）, free radicals（自由基）等 |
| 低度揮發(fā)性物質(zhì) | products of peroxidation（氧化反應(yīng)產(chǎn)物）, H2O2 , 其他醛、脂肪酸、脂質(zhì)等 |
| 非揮發(fā)性物質(zhì) | 金屬離子、非金屬離子、無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)、DNA、生物氣溶膠等 |
在Medline（生物醫(yī)學(xué)）數(shù)據(jù)庫中搜索呼出氣冷凝液相關(guān)文獻(xiàn)，通過PubMed使用 “Exhaled breath condensate”關(guān)鍵詞可搜索到1705篇文獻(xiàn)（2001~2021年）；通過PubMed使用“Exhaled breath condensate and biomarker”兩個(gè)關(guān)鍵詞可搜索到相關(guān)文獻(xiàn)894篇（2001~2021年），可見人們對(duì)呼出氣冷凝液（EBC）的研究熱情一直非常高，且創(chuàng)新性論文增長迅速，幾乎涵蓋現(xiàn)代呼吸醫(yī)學(xué)的所有領(lǐng)域。
I.生物標(biāo)志物的研究
大量研究表明，呼出氣冷凝液中的多種生化物質(zhì)的濃度變化（或有無的變化）與呼吸系統(tǒng)的病理狀態(tài)密切相關(guān)，這些生化物質(zhì)被稱為潛在的生物標(biāo)志物（biomarkers），它們很有希望應(yīng)用于臨床診斷：科研工作者通過收集并分析含有生物標(biāo)志物的EBC樣本，從中發(fā)現(xiàn)各種生物標(biāo)志物與疾病之間的關(guān)系，進(jìn)而深入了解和洞悉疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和機(jī)理等，應(yīng)用于如肺癌的早期診斷和高危人群中的篩查；哮喘、慢性阻塞性肺疾�。–OPD）等呼吸道疾病的動(dòng)態(tài)監(jiān)測、療效驗(yàn)證和病情評(píng)估等方面。
與呼吸道炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的潛在的多種生物標(biāo)志物得到廣泛而充分的研究。如pH、過氧化氫，白三烯（LTs)，8-異前列腺素和細(xì)胞因子等生物標(biāo)志物。
pH代表呼吸道表面黏液的酸化程度，呼吸道的炎癥與氣道酸化即EBC-pH降低相關(guān)，如研究表明哮喘加重期、COPD 患者的EBC-pH較正常人低，支氣管哮喘的吸煙人群EBC-pH 降低。
過氧化氫（H2O2）是人體氧化應(yīng)激的標(biāo)志性產(chǎn)物之一。EBC-H2O2的水平與肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺疾�。–OPD）、肺纖維化等疾病的關(guān)系都有深入的研究。如研究發(fā)現(xiàn)：非吸煙者哮喘患者的EBC-H2O2水平顯著高于健康受試者，特別是成人哮喘患者的EBC-H2O2水平高于健康受試者，而哮喘患兒EBC-H2O2濃度與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，EBC-H2O2水平與哮喘的嚴(yán)重程度和控制狀態(tài)相關(guān)，所以過氧化氫有可能作為指導(dǎo)哮喘治療的生物標(biāo)志物。大量研究發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾�。–OPD）患者中EBC-H2O2也顯著升高，但急性COPD患者經(jīng)治療后EBC-H2O2降低。
白三烯（LTs）是白細(xì)胞產(chǎn)生的花生四烯酸（AA）經(jīng)5-脂氧合酶（5-LOX）途徑代謝產(chǎn)生的一組炎性介質(zhì)，包括白三烯B4(LTB4)、半胱氨�；兹�(CysLTs)等，其中白三烯B4(LTB4)是目前所知作用最強(qiáng)的粒細(xì)胞趨化因子，如在哮喘和COPD患者中能發(fā)現(xiàn)EBC-LTB4的升高。半胱氨�；兹�(CysLTs)具有誘導(dǎo)平滑肌收縮，增加血管通透性，刺激黏液分泌并減少黏膜纖毛清除率等作用，它們參與包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張等多種氣道炎癥性疾病的發(fā)病過程。前列腺素E2（PGE2）和8-異前列腺素也是花生四烯酸的衍生產(chǎn)物，PGE2有促炎作用和抑制支氣管收縮，EBC-PGE2水平的升高可能反映了哮喘患者的吸煙狀況。 8-異前列腺素是花生四烯酸被自由基氧化后生成的產(chǎn)物，被認(rèn)為是測定體內(nèi)氧化應(yīng)激的金指標(biāo)。在急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、急性肺損傷、哮喘和兒童呼吸道炎癥等多種肺部疾病中，研究發(fā)現(xiàn)EBC-8-isoPG水平都有顯著的升高。
細(xì)胞因子(cytokine，CK)是由多種組織細(xì)胞（主要為免疫細(xì)胞）所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，它們具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)、腫瘤消長等多種生物學(xué)功能。在EBC中發(fā)現(xiàn)了多種與哮喘，COPD及肺癌相關(guān)的細(xì)胞因子生物標(biāo)志物。如促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（ILs），其中IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10和IL-17在哮喘穩(wěn)定期表達(dá)升高；兒童哮喘人群中，EBC-IL-4水平升高，同時(shí)干擾素γ水平降低。腫瘤壞死因子TNF-α也是炎癥標(biāo)志物之一，在急性COPD,哮喘和肺癌患者中均發(fā)現(xiàn)EBC-TNF-α水平升高。
下表二中列舉了部分文獻(xiàn)報(bào)道的生物標(biāo)志物的研究成果。
表二 呼出氣冷凝液潛在的生物標(biāo)志物與相關(guān)疾病的關(guān)系
| 生物標(biāo)志物（biomarker） | 相關(guān)疾�。≧elated Disease） |
| pH | 哮喘加重期、COPD 患者的EBC-pH較正常人低；支氣管哮喘的吸煙人群pH 降低；穩(wěn)定期哮喘患者和健康對(duì)照組之間的EBC-pH沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 |
| 過氧化氫（H2O2） | 哮喘、COPD等呼吸道炎性疾病的成年患者H2O2顯著增加；肺癌H2O2增加 |
| 亞硝酸鹽 | 急性COPD加重期升高 |
| 白三烯(LTs) | 哮喘患者LTB4和半胱氨酰基白三烯(CysLTs)增加； COPD和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的EBC-LTB4升高 |
| 前列腺素（PGE2） | 吸煙的哮喘患者PGE2升高 |
| 8-異前列腺素（8-isoPG） | 哮喘患者（成人和兒童）8-isoPG升高 |
| 細(xì)胞因子ILs | 哮喘患者的EBC-ILs升高；COPD 患者的IL-1β，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12p70升高；肺癌患者 IL-6 等指標(biāo)升高； EBC-IL-2水平與肺炎嚴(yán)重程度相關(guān) |
| 細(xì)胞因子TNF-α | 肺癌，急性COPD與穩(wěn)定期哮喘EBC-TNF-α升高；EBC-TNF-α水平與肺炎相關(guān) |
| 趨化因子RANTES | 與哮喘嚴(yán)重程度正相關(guān) |
| EBC基因組分析 |
肺癌患者的EBC-p53體細(xì)胞突變；非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的DAPK、PAX5和p16基因的甲基化； 非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者發(fā)現(xiàn)有HPV基因組 |
應(yīng)該指出的是，近些年來，EBC蛋白質(zhì)組分析、基因組分析以及代謝組學(xué)分析的研究越來越多。EBC組學(xué)分析取得了很多令人印象深刻的研究結(jié)果。如對(duì)EBC的廣泛蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了與哮喘的病理生理機(jī)制相關(guān)的生物標(biāo)志物。在Bloemen 等人的研究中，哮喘兒童的EBC-細(xì)胞角蛋白1水平顯著高于健康對(duì)照組，而EBC-細(xì)胞角蛋白2、5、6、8、9、10、14和16、白蛋白、肌動(dòng)蛋白、血紅蛋白、溶菌酶、鈣顆粒蛋白B和結(jié)蛋白的濃度沒有顯著差異。在EBC基因組分析方面，如對(duì)肺癌患者的EBC基因組分析，檢測到p53基因的體細(xì)胞突變，而在健康對(duì)照組中未檢測到；對(duì)NSCLC患者的EBC分析發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星DNA不穩(wěn)定性和雜合性缺失：3p染色體(位點(diǎn)D3S2338、D3S1266、D3S1304、D3S1289)。對(duì)重度吸煙者和NSCLC患者中都發(fā)現(xiàn)了相同的微衛(wèi)星EBC-DNA變化。Eva Borras等人研究了流感感染者和流感疫苗接種者的呼出氣冷凝液的生物標(biāo)志物。通過液相色譜法結(jié)合四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（LC-qTOF）的檢測技術(shù)對(duì)呼出冷凝液（EBC）樣品進(jìn)行分析，使用靶向和非靶向方法分析所有代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，以檢測炎癥和氧化應(yīng)激生物標(biāo)記物中的特定已知生物標(biāo)記物，以及與特定感染相關(guān)的新分子。研究結(jié)果表明能夠找到流感疫苗接種前后采集的呼吸樣本之間的明顯差異，以及與炎癥過程和氧化應(yīng)激相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物等。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究甲型流感和其他病毒在人體系統(tǒng)中的作用提供了非常有希望的信息。Annalisa Campanella等則根據(jù)EBC肺癌候選生物標(biāo)記物的來源（基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組、代謝組、蛋白質(zhì)組和微生物群）將其進(jìn)行分類，證明EBC分析在癌癥診斷、分子分析、治療監(jiān)測和高危人群篩查中的潛在用途。
II.臨床應(yīng)用
分析廣泛應(yīng)用于肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、職業(yè)性肺損傷等肺部疾病的臨床研究，也有不少關(guān)于細(xì)菌或病毒性呼吸道感染，包括最近兩年來席卷全球的新冠病毒肺炎的研究報(bào)道。前面討論EBC的生物標(biāo)志物時(shí)能夠看到很多的EBC分析在肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺病等肺部疾病的臨床應(yīng)用的例子，在此不再贅述。
在EBC-細(xì)菌和病毒研究方面，如Yunhao Zheng等人使用商業(yè)化的EBC收集裝置(北京鼎藍(lán)BioScreenII)與LAMP（環(huán)介等溫?cái)U(kuò)增）方法相結(jié)合,研究呼吸道感染癥狀的受試者的EBC中可能存在的細(xì)菌性病原微生物。研究結(jié)果證明流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和MRSA，可以通過呼出的氣體從感染者中釋放出來,也證明了流感嗜血桿菌是導(dǎo)致常見呼吸道感染的主要病原體。研究表明EBC結(jié)合LAMP分析方案提供了一種可能的快速、有效、無創(chuàng)的感染病原體的診斷方法。
在新冠病毒肺炎的臨床應(yīng)用方面，在pubmed中輸入“Exhaled Breath Condensate，COVID-19”關(guān)鍵詞，可搜索到15篇相關(guān)文獻(xiàn)，這些研究為EBC分析在新冠肺炎的臨床診斷等方面做了初步而有益的探索。如Makoto Sawano等收集48名2019-冠狀病毒疾病患者的EBC樣本，并結(jié)合RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）技術(shù)（即RT-PCR）定量分析病毒的靶向E基因來確定病毒載量，對(duì)檢測率和病毒載量相對(duì)于患者特征和發(fā)病天數(shù)的變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)估，研究結(jié)果表明需要機(jī)械通氣與較高的病毒載量顯著相關(guān)（p<0.05）；需要吸氧或機(jī)械通氣、發(fā)病后少于3天、咳嗽或發(fā)熱與較高的檢出率顯著相關(guān)（p<0.05）。在自發(fā)呼吸患者中，EBC-病毒載量隨時(shí)間呈指數(shù)衰減。發(fā)病后第2天的檢出率為86%，此后惡化。在機(jī)械通氣患者中，無論發(fā)病后幾天，檢出率和病毒載量都很高。這些結(jié)果支持了對(duì)發(fā)病后2天內(nèi)的COVID-19患者使用RT-PCR技術(shù)檢測EBC-新冠病毒的可行性。
三、呼出氣冷凝液采集裝置與技術(shù)
I.呼出氣冷凝液采集裝置
目前臨床研究上絕大多數(shù)EBC收集裝置為商業(yè)化采集器，如R-Tube、EcoScreen、TURBO-DECCS、ANACON、BioscreenII等，適用范圍包括自主呼吸和機(jī)械通氣的患者。我們以呼出氣采集器BioscreenII為例來介紹呼出氣冷凝液的采集裝置及技術(shù)。
BioscreenII是北京鼎藍(lán)科技有限公司研發(fā)的呼出氣冷凝液采集器，是一款便攜且快速采集呼出氣冷凝液（Exhaled Breath Condensate, EBC）的裝置（見圖1左）。該采集裝置由采集器主機(jī)、電源適配器和一次性無菌采樣耗材（分離蓋、采集管和吹氣管）組成。（設(shè)備詳情請(qǐng)參考：http://www.dingbluetech.com/product/278199832）
BiscreenII的主要特點(diǎn)：（1） BioscreenII采用了先進(jìn)的半導(dǎo)體制冷元器件和電動(dòng)制冷方式，平均降溫速率為5℃/min；選用50ml離心管，加大冷凝接觸面積，進(jìn)一步加快冷凝速度，使呼出氣迅速液化形成冷凝液；（2）采集溫度為-5℃~0℃，出廠默認(rèn)-4℃，且能實(shí)時(shí)顯示冷凝溫度；（3）特有的分離蓋設(shè)計(jì)，使呼出氣在離心管內(nèi)形成旋風(fēng)氣流，推動(dòng)水霧形成液滴，減少液膜形成，同時(shí)可不斷吹落側(cè)壁冷凝液滴，匯集到冷凝管底部，提高了樣品收集率，采集效率為200μL/min，3～5分鐘就可采集0.5～1ml冷凝液；同時(shí)使采集者呼出的氣體與唾液有效分離；(4)該裝置外形尺寸為255*215*120mm，總重量2.0kg，輕巧便攜。
圖1 呼出氣采集器BioscreenII（左）和 呼出氣冷凝液的采集（右）
II.呼出氣冷凝液采集技術(shù)
與支氣管肺泡灌洗(BAL)等具有相對(duì)侵入性和挑戰(zhàn)性的技術(shù)方法相比，呼出氣冷凝液的采集無疑是一種先進(jìn)的無創(chuàng)、輕松、無痛的技術(shù)，只需要被采集者簡單地潮汐呼吸。
（1）采集原理
患者在平靜呼吸時(shí)將呼出氣吹進(jìn)低溫密閉采集裝置（見圖1右），同時(shí)裝置的冷凝系統(tǒng)使氣體凝結(jié)形成液滴并收集在采集管中，采集的樣品可進(jìn)一步低溫儲(chǔ)存或檢測分析。
（2）采集過程
采集前，被采集者應(yīng)該避免運(yùn)動(dòng)、抽煙或者進(jìn)食一些特殊的食物如咖啡因類飲料、碳酸飲料等，因?yàn)橛醒芯勘砻鞒闊熀吞厥獬煞值娘嬃蠒?huì)導(dǎo)致EBCD的某些生物標(biāo)志物濃度的變化；采集前先清水（或特定的溶液）漱口，休息十分鐘，保持呼吸平靜。當(dāng)采集器的準(zhǔn)備工作完畢，采集冷凝溫度降至-5℃時(shí)，被采集者對(duì)吹氣管均勻正常地吹氣：吹氣時(shí)保持用鼻吸氣，用嘴呼；盡量將肺部余氣吹出，有利于提高內(nèi)容物的檢出率。吹氣采集時(shí)間一般為3～5分鐘，采集結(jié)束后，立刻取出采集管進(jìn)行低溫儲(chǔ)存或用于檢測分析。
（3）注意事項(xiàng)
采集過程中需要特別注意的兩個(gè)問題：一是防止EBC樣品的污染，如在采集過程中防止采集管的污染，防止唾液、口腔和上呼吸道的內(nèi)容物等對(duì)EBC的污染等。二是采集的EBC樣品的維護(hù)，可根據(jù)檢測分析的需要采取合適的低溫（如-70℃）存儲(chǔ)以防止樣品中的生化物質(zhì)的降解變質(zhì)，必要時(shí)需將樣品分裝保存以防止EBC 樣品的反復(fù)凍融等。
（4）面臨的問題
各種不同品牌的商業(yè)化呼出氣冷凝液采集器被廣泛應(yīng)用于EBC的研究，但研究者也注意到一些問題：（1）環(huán)境條件的不同，采集器裝置和采集操作的不同，都可能導(dǎo)致采集到的呼出氣冷凝液“內(nèi)容物”有所不同。如有研究表明環(huán)境溫度和相對(duì)濕度對(duì)EBC-pH的變化有貢獻(xiàn)；EBC中的過氧化氫水平在48-140mL/s的呼氣流量下具有流量依賴性等。所以，對(duì)不同品牌收集器的呼出氣冷凝液進(jìn)行比較研究，對(duì)EBC收集操作進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化也是EBC研究面臨的課題之一。（2）另一個(gè)應(yīng)用的難題是EBC是一種含有大量水蒸氣的基質(zhì)，因此大多數(shù)生物標(biāo)志物被高度稀釋，接近較低的檢測靈敏度極限，有必要建立一個(gè)能夠反映氣道中各生物標(biāo)志物實(shí)際水平的EBC稀釋指標(biāo)，但目前還沒有金標(biāo)準(zhǔn)稀釋因子（gold standard dilution factor）被定義并廣泛用于研究。另外，從采集的角度來看，更有效地采集與富集裝置也有待研究，如研究發(fā)現(xiàn)：將呼出氣冷凝液（EBC）凍干再進(jìn)行檢測分析，則其生物標(biāo)志物的濃度可有效提高20倍。
四，總結(jié)與展望
EBC分析是一種有臨床應(yīng)用前景的肺功能指標(biāo)檢測新技術(shù)。一方面，呼出氣冷凝液(EBC)提供了一種新的診斷呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物的標(biāo)本，通過分析EBC的生物標(biāo)志物的變化，可提供下呼吸道和肺部可能的病理狀態(tài)的信號(hào)，用于疾病早期的診斷、篩查，監(jiān)測病情進(jìn)程與療效評(píng)估，也能為疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供諸多有用信息等。另一方面，呼出氣冷凝液收集設(shè)備具有便攜的特點(diǎn)，且收集不受年齡、性別、病情程度的影響與限制等，幾乎可以應(yīng)用于所有患者，包括小兒患者、機(jī)械通氣患者及昏迷患者等。因此，EBC分析作為一種完全無創(chuàng)、簡便快捷、應(yīng)用人群廣泛、可實(shí)現(xiàn)疾病動(dòng)態(tài)監(jiān)測等優(yōu)勢的新技術(shù)，受到眾多的醫(yī)學(xué)與科研工作者的重視與青睞。
目前EBC的研究還處于臨床應(yīng)用的初級(jí)階段，尚還存在著很多亟待解決的問題，其中最主要的問題是“標(biāo)準(zhǔn)化”的問題：如（1）呼出氣冷凝液作為一種如同血液，尿液的生化標(biāo)本，其組分十分復(fù)雜，尚無大規(guī)模人群的研究報(bào)道，缺乏各種生物標(biāo)志物在EBC中的正常參考值；（2）確定的正常人的呼出氣冷凝液的蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和基因組學(xué)“指紋”還沒有被發(fā)現(xiàn)和沒有被充分描述；（3）現(xiàn)有的知識(shí)（knowledge）基于小規(guī)模研究提供的數(shù)據(jù)，通常顯示出相互矛盾的結(jié)果，可能歸因于EBC生物標(biāo)記物的再現(xiàn)性差；（4）EBC的稀釋度在個(gè)體間存在著很大的差異，目前尚缺乏確定EBC稀釋度統(tǒng)一的方法，從而可能會(huì)影響對(duì)檢測結(jié)果的評(píng)估；（5）研究者所用的設(shè)備或收集及檢測方法技術(shù)不同，可能得出不同的結(jié)果，也使得結(jié)果之間缺乏可比性等等。
總而言之，EBC分析是生物醫(yī)學(xué)研究的一項(xiàng)有趣的成就，也是一項(xiàng)有希望成為肺部疾病及全身性疾病診斷的重要技術(shù)。特別是近些年來，隨著基因組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等生命學(xué)科的飛速發(fā)展，同時(shí)分子檢測分析技術(shù)也在高速發(fā)展，如高分辨質(zhì)譜分析技術(shù)，核酸擴(kuò)增-檢測技術(shù)，以及生物樣品處理與富集技術(shù)的突破與發(fā)展等，為EBC分析開拓了以蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子及細(xì)菌病毒微生物氣溶膠為生物標(biāo)志物的研究新視角和新領(lǐng)域。
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