骨發(fā)育的重要因子Mmp13基因與小鼠模型

賽業(yè)生物《每周一鼠》，每周五更新，為大家講解一個(gè)小鼠模型的故事，希望對(duì)大家了解不同的小鼠模型有所幫助。今天和大家見面的是Mmp13基因敲除小鼠。

Mmp13基因
MMP13屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，是一種膠原酶，該家族蛋白參與如胚胎發(fā)育、組織重塑等正常生理過程，還參與疾病過程中的細(xì)胞外基質(zhì)分解。該蛋白的主要功能除了參與骨關(guān)節(jié)中的Col II降解外，還可以降解軟骨中其他類型的膠原如IV型、IX型，和軟骨基質(zhì)成分蛋白多糖等。MMP13及其抑制劑（MMPIS）的失衡是導(dǎo)致Col II降解的起始因素，正常情況下，二者以1:1的比例存在于軟骨細(xì)胞的胞外基質(zhì)中，進(jìn)而維持基質(zhì)的相對(duì)平衡。
 

圖1. Mmp13基因基本信息^【4】。

研究人員發(fā)現(xiàn)，MMP13在人類正常的組織中含量較低，而在骨關(guān)節(jié)炎患者中MMP13含量在結(jié)締組織中有很高的表達(dá)量。MMP13表達(dá)下調(diào)會(huì)在一定范圍內(nèi)控制骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）發(fā)病進(jìn)程；而MMP13轉(zhuǎn)錄水平一旦上調(diào)，軟骨細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡就會(huì)遭到破壞，進(jìn)而使疾病更加嚴(yán)重。除此之外，MMP13還與脊椎干骺端發(fā)育不良有關(guān)。與之相關(guān)的通路包括AGE/RAGE信號(hào)傳導(dǎo)通路和激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)GTP酶信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)。GO分析顯示該基因與鈣離子結(jié)合活性和金屬內(nèi)肽酶活性相關(guān)。
 

圖2. MMP13蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測^【3】。

Mmp13敲除小鼠
純合Mmp13敲除小鼠有肥大軟骨細(xì)胞區(qū)的寬度增加以及小梁骨增加的表型

Stickens D等人為了評(píng)估骨骼中哪些細(xì)胞表達(dá)Mmp13，在軟骨骨化過程的不同階段對(duì)小鼠脛骨進(jìn)行原位雜交。在胚胎期15天，Mmp13在肥大軟骨細(xì)胞和原發(fā)性骨化中心新募集的骨細(xì)胞中表達(dá)（圖3左）。在生長板建立后，Mmp13的表達(dá)僅限于肥大軟骨細(xì)胞群末端和小梁成骨細(xì)胞（圖3右）。
 

圖3. Mmp13在骨化過程中的表達(dá)^【5】。

左圖通過對(duì)胚胎期15天野生型小鼠脛骨的原位雜交檢測Mmp13表達(dá)。Mmp13信號(hào)用紅色表示。黃色虛線表示骨化前沿。藍(lán)色表示Hoechst復(fù)染劑。在肥大軟骨細(xì)胞群（HC）和原發(fā)性骨化中心（PO）中能觀察到Mmp13表達(dá)，在增殖軟骨細(xì)胞 （PC） 群中沒有觀察到Mmp13的表達(dá)。右圖通過原位雜交檢測1周齡野生型小鼠趾骨上的Mmp13表達(dá)。結(jié)果與在左圖中觀察到的表達(dá)模式相反，Mmp13表達(dá)僅限于肥大軟骨細(xì)胞的最末端（箭頭指示），TB代表小梁骨。

在軟骨成骨過程中，MMP13的缺乏導(dǎo)致生長板結(jié)構(gòu)改變和骨小梁增加

用茜素紅和阿爾新藍(lán)對(duì)Mmp13敲除小鼠的整個(gè)骨骼進(jìn)行染色表明，與野生型同窩小鼠相比，所有骨骼無明顯差異且長度基本相等（圖4A）。因?yàn)槊劰呛王殴窃谏�長板的閉合上存在較大差異，因此研究人員著重對(duì)其進(jìn)行微觀分析。跖骨大約在四周齡的時(shí)候生長板就會(huì)閉合，而在完全發(fā)育的脛骨中，會(huì)保留一小部分生長板軟骨。在15日齡，跖骨和脛骨都能觀察到骨化中心的形成（圖4D），在這個(gè)階段，有文獻(xiàn)結(jié)果顯示，Mmp13的mRNA在肥大軟骨細(xì)胞中高表達(dá)，并與X型膠原蛋白共定位，Mmp13還會(huì)在向礦化軟骨基質(zhì)的成骨細(xì)胞中表達(dá)。

在該研究中，15日齡的Mmp13敲除和野生型小鼠的長骨之間沒有明顯的差異（圖4B,C）。因此，在缺少M(fèi)mp13的情況下，軟骨骨化的初始階段似乎沒有受到影響。研究人員還發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物1周齡之前，Mmp13敲除小鼠跖骨的肥大區(qū)也變得明顯（圖4D,E）。這種表型的嚴(yán)重程度與骨骼的類型具有很高的相關(guān)性，通過比較可以發(fā)現(xiàn)，跖骨肥大區(qū)的擴(kuò)張比脛骨更明顯（圖4F,G）。Mmp13敲除小鼠在出生后5周齡，表型都會(huì)隨著骨生長而變得嚴(yán)重。5周后，骨生長速度減慢，同時(shí)肥大的軟骨細(xì)胞群逐漸恢復(fù)到正常的數(shù)量。到12周齡時(shí)，生長板相關(guān)表型得到改善（圖4H,I）。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，番紅素O對(duì)突變的生長板具有更高的染色附著力，這表明，Mmp13有助于蛋白多糖的轉(zhuǎn)換。
 

圖4. Mmp13敲除小鼠中生長板缺陷的組織學(xué)檢查^【5】。
（A）2周齡野生型和Mmp13敲除小鼠整體骨骼的茜素紅/阿爾新藍(lán)染色，結(jié)果顯示不同基因型之間的整體骨骼結(jié)構(gòu)沒有明顯差異。
（B, C）對(duì)胚胎期15天野生型和Mmp13敲除小鼠的脛骨進(jìn)行染色，結(jié)果顯示兩種基因型的骨干中都存在礦化組織。在不同基因型中，增殖軟骨細(xì)胞（PC）區(qū)、肥大軟骨細(xì)胞（HC）區(qū)和原發(fā)性骨化中心（PO）都沒有明顯差異。
（D, E）10日齡野生型和Mmp13敲除小鼠的跖骨番紅O染色結(jié)果
（F, G）10日齡野生型和Mmp13敲除小鼠的脛骨番紅O染色結(jié)果。Mmp13敲除小鼠生長板的肥大軟骨細(xì)胞（HC）區(qū)域擴(kuò)大（黑條雙箭頭表示的長度）。
（H，I）12周齡的野生型和 Mmp13敲除小鼠的脛骨番紅O染色結(jié)果。之前觀察到的肥大軟骨擴(kuò)張表型得到改善，但番紅O在突變小鼠生長板中附著力更強(qiáng)，TB代表小梁骨。

治療方法
Mmp13敲除小鼠會(huì)有骨發(fā)育相關(guān)的問題，而人的Mmp13與OA具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。OA是臨床上最常見的慢性關(guān)節(jié)疾病，OA對(duì)全球3.03億患者造成病痛，患病率隨著年齡增長逐漸增加，對(duì)中老年人的身體健康造成嚴(yán)重威脅。

OA 的治療方式分為基礎(chǔ)治療、藥物治療和手術(shù)治療，其中藥物治療是OA的重要治療方法，廣泛適用于中早期的OA患者，中老年患者易于接受。傳統(tǒng)OA治療藥物有對(duì)乙酰氨基酚、非甾體抗炎藥、氨基葡萄糖和軟骨素、糖皮質(zhì)激素、透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸、5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取抑制劑、醫(yī)用幾丁糖、雙醋瑞因和富血小板血漿，大多以緩解癥狀為主。

新型OA藥物包括白介素-1（IL-1）抑制劑、腫瘤壞死因子（TNF-α）抑制劑、成纖維細(xì)胞生長因子 18、β-神經(jīng)生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β 抑制劑、Wnt 信號(hào)通路抑制劑、骨形態(tài)蛋白-7。