天信和固定床生物反應器貼壁細胞培養(yǎng)操作指南
下面為大家詳解天信和固定床生物反應器貼壁細胞培養(yǎng)操作步驟，以便您更好地理解貼壁細胞的操作過程。
操作步驟詳解
一、清洗固定床生物反應器
1. 擰掉頂蓋上的密封螺絲，取出罐體頂蓋和固定籃；
2. 用純化水沖洗玻璃罐內(nèi)外壁和法蘭盤；
3. 用柔軟紗布擦洗罐體內(nèi)部；
4. 反復沖洗固定篩片、套管、深層通氣管等；
5. 用柔軟紗布擦洗電極、槳葉等所有組件；
6. 用注射用水沖洗罐體內(nèi)外壁和所有組件。
二、安裝固定床生物反應器
1. 倒入已經(jīng)完全膨脹、濕潤的Cellcomb載體；
2. Cellcomb載體分布均勻后，下調(diào)固定籃上篩片，然后擰緊固定螺絲；
3. 倒入pH為7.4左右的PBS溶液清洗1次；
4. 再次倒入PBS溶液沒過載體、電極；
5. 安裝好頂蓋并擰緊螺絲；
6. 安裝工藝軟管并用止血鉗夾緊軟管；
7. 氣密性檢查：通入壓縮空氣，罐內(nèi)壓力升到0.5bar左右，停止通氣并夾緊進氣軟管，放置6h檢查罐體內(nèi)的氣壓，6h后壓力表沒有變化，則表示氣密性良好；
8. 高壓滅菌：打開尾氣、表層進氣管路上止血鉗，將罐體及所有組件進行高壓滅菌，滅菌程序為敞口液體程序121℃，45分鐘；
9. 滅菌結束后取出罐體，并放置至室溫；
10. 將反應器罐體與控制器連接，連接溫度、DO、pH、加熱毯、攪拌電機等；
11. 在無菌環(huán)境下將反應器與廢液桶、培養(yǎng)液桶、接種瓶等連接；
12. 接入壓縮空氣，將反應器罐內(nèi)PBS通過管路排至廢液桶，用細胞培養(yǎng)液清洗載體2次；
13. 再次加入細胞培養(yǎng)液，沒過攪拌槳葉、pH電極等，調(diào)整反應器參數(shù)，進行細胞預培養(yǎng)。
三、細胞貼壁培養(yǎng)
1. 接入待培養(yǎng)的動物細胞；
2. 將溫度設置為37℃，溶氧為40%，pH值為7.0左右進行細胞培養(yǎng)；
3. 每24小時在線取樣一次，進行生化檢測和pH值測量；
溫馨提示：共取兩管樣品，第一管廢棄，只保留第二管樣品；液體單向流動，只出不進。
4. 取樣后將取樣管末端浸入75%的酒精。
溫馨提示：每24小時或每次操作都需填寫生物反應器操作記錄
四、下罐操作
1. 關掉控制面板上的所有的自動控制，只保留攪拌功能；
2. 用止血鉗夾住深層進氣和尾氣出氣，開啟表層進氣，并調(diào)節(jié)進氣流量；
3. 拆掉加熱毯，關掉攪拌功能，松開進氣管道；
4. 將罐內(nèi)培養(yǎng)液排入廢液桶；
5. 排液完成后，夾緊進氣管道和排液管道；
6. 斷開電極與控制柜的連接，拆掉所有管路和附件；
7. 拆掉頂蓋螺絲，打開頂蓋，擰掉固定籃上的螺絲，取出上篩片；
8. 取樣：分別在上層、中層及下層各取0.5g Cellcomb載體樣品；
9. 在Cellcomb載體樣品中加入10ml結晶紫，將加入結晶紫的載體樣品放入搖床中（過夜后進行細胞計數(shù)）；
10. 用純化水反復沖洗反應器固定篩片，并用柔軟紗布擦洗，仔細沖洗、擦拭罐體內(nèi)外壁、漿葉及其他組件；
11. 清洗完成后擰上頂蓋螺絲，罐體內(nèi)裝滿0.1M的氫氧化鈉浸泡過夜。
五、細胞計數(shù)
過夜后對Cellcomb載體樣品進行細胞計數(shù)：
1. 從搖床中取出載體樣品并充分搖晃；
2. 在EP管內(nèi)加入PBS溶液，將樣品移入EP管中進行稀釋；
3. 用移液槍反復吹打細胞懸液；
4. 將稀釋后的細胞懸液打在細胞計數(shù)板上；
5. 在顯微鏡下進行細胞計數(shù)。
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