新冠研究前沿：在iPS中利用CRISPRi系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)病毒感染新機(jī)制（NEPA21）

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是一種嚴(yán)重的急性呼吸道傳染性疾病，其由急性呼吸綜合征冠狀病毒SARS-CoV-2感染所致。自COVID-19新冠肺炎疫情爆發(fā)至今，已兩年有余。除了疫苗接種，目前醫(yī)學(xué)界還沒(méi)有針對(duì)治療新冠的特效藥問(wèn)世。而關(guān)于其感染機(jī)制的研究，對(duì)于新冠藥物的研發(fā)至關(guān)重要。
 

據(jù)報(bào)導(dǎo)，SARS-CoV-2的感染需要許多受體和蛋白酶。在感染期間，SARS-CoV-2刺突（S）蛋白與細(xì)胞表面表達(dá)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）結(jié)合，并被跨膜蛋白酶絲氨酸2（TMPRSS2）等蛋白酶切割，導(dǎo)致S蛋白分裂為S1和S2結(jié)構(gòu)域。SARS-CoV-2通過(guò)S2結(jié)構(gòu)域融合和侵入細(xì)胞。因此，SARS-CoV-2感染被認(rèn)為是依賴于宿主細(xì)胞中ACE2和TMPRSS2的表達(dá)。然而，除了ACE2和TMPRSS2之外的其他蛋白分子也在SARS-CoV-2感染中起著重要作用。
 

近期，有研究學(xué)者通過(guò)通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)和表達(dá)ACE2的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）檢測(cè)了神經(jīng)纖毛蛋白-1（NRP1）、堿性蛋白BSG、跨膜絲氨酸蛋白酶（TMPRSS）和組織蛋白酶（CTS）在SARS-CoV-2感染中的作用。該研究發(fā)現(xiàn)雙重敲降TMPRSS2和組織蛋白酶B（CTSB）可將病毒載量降低至0.036%±0.021%。CTPB抑制劑CA-074甲酯和TMPRSS2抑制劑Camostat的組合更將病毒載量降低至0.0078%±0.0057%。這些研究結(jié)果都在四種SARS-CoV-2的變異株（β.1.3、β.1.1.7、β.1.351和β.1.1.248）中得到證實(shí)。同時(shí)使用這兩種藥物都可將人類男性和女性iPS中的病毒載量降低到0.01%以下。這些發(fā)現(xiàn)表明，對(duì)于TMPRSS2和CTSB的靶向化合物表現(xiàn)出高效的抗病毒效果，這可以為COVID-19的治療藥物研發(fā)提供一種思路。
 

為了闡明除ACE2以外的受體和蛋白酶在SARS-CoV-2感染中的功能，該研究通過(guò)使用過(guò)表達(dá)ACE2的iPS（ACE2 iPS）和CRISPRi系統(tǒng)抑制了BSG、CTSB和TMPRSS2基因的表達(dá)水平，并設(shè)計(jì)了針對(duì)這些基因的sgRNA。用表達(dá)sgRNAs、mKate2和抗病毒基因的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染iPS，如下圖所示。

在比較通過(guò)dCas9蛋白表達(dá)抑制ACE2的iPS中目標(biāo)基因的表達(dá)水平后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行SARS-CoV-2感染，如下圖所示。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTSL、CTSB和TMPRSS2的抑制使得ACE2 iPS中的病毒RNA拷貝數(shù)分別降低至11.7%±3.77%、0.84%±0.062%和20.6%±10.4%。TMRPSS2的抑制始終減少了刺突（S）蛋白的ACE2 iPS的數(shù)量。這些結(jié)果表明，CTSB、CTSL和TMPRSS2參與了ACE2 iPS的SARS-CoV-2感染。
 

基于上述發(fā)現(xiàn)，該研究團(tuán)隊(duì)接下來(lái)探究了CTSB、CTSL和TMPRSS2抑制劑是否能抑制ACE2 iPS中的SARS-CoV-2感染。用SARS-CoV-2感染表達(dá)ACE2的iPS后，細(xì)胞在CA-074甲酯（CA-074 Me，CTSB抑制劑）、Z-Phe-Tyr（tBu）-重氮乙基酮（CTSL抑制劑）、卡莫司他（TMPRSS2抑制劑）或納法莫司他（TMPRSS2抑制劑）的存在下培養(yǎng)，如下圖所示。

最后，該研究團(tuán)隊(duì)檢測(cè)了TMRPSS2和CTSB的雙重敲降機(jī)制對(duì)于ACE2 iPS的SARS-CoV-2感染的影響作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染的CTSB和TMPRSS2雙基因敲降細(xì)胞中的病毒RNA拷貝數(shù)低于感染的單基因敲降細(xì)胞中的病毒RNA拷貝數(shù)，如下圖所示。

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可以使用轉(zhuǎn)錄阻遏物結(jié)構(gòu)域（KRAB）和短引導(dǎo)RNA（sgRNA）融合的降解蛋白Cas9（dCas9）選擇性地抑制靶基因的表達(dá)。CRISPRi和iPS的組合可以將靶基因的表達(dá)抑制到1%或更低。此外，在由iPS誘導(dǎo)的體細(xì)胞中，該表達(dá)也保持低水平。到目前為止，利用iPS衍生的體細(xì)胞進(jìn)行的SARS-CoV-2研究已得到廣泛開(kāi)展。
 

值得一提的是，為了進(jìn)行CRISPRi實(shí)驗(yàn)，該研究團(tuán)隊(duì)使用來(lái)自NEPA GENE的NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，并最終獲得了成功理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

 

NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)采用獨(dú)特設(shè)計(jì)的電轉(zhuǎn)程序，可應(yīng)用細(xì)胞、離體組織或動(dòng)物活體的轉(zhuǎn)染。配合獨(dú)有的電壓衰減（Voltage/Decay）設(shè)計(jì)，可在獲得高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，提高細(xì)胞存活率。專門(mén)針對(duì)難轉(zhuǎn)染的原代免疫細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、活體動(dòng)物、受精卵及宮內(nèi)胚胎等轉(zhuǎn)染。目前已有眾多應(yīng)用文獻(xiàn)發(fā)表在高水平學(xué)術(shù)期刊，是基因編輯、細(xì)胞免疫等前沿生物研究中的首選品牌！
 

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