干細(xì)胞污染防控技術(shù)

在干細(xì)胞的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究飛速發(fā)展的今天, 干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和實(shí)際應(yīng)用中可能出現(xiàn)的安全問題越來越受關(guān)注。相對于干細(xì)胞內(nèi)源性污染，外源性污染防控更重要。本文介紹一種如何控制外源性污染的方法。
干細(xì)胞是一類具有高度自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞, 是構(gòu)成機(jī)體所有功能細(xì)胞的種子細(xì)胞 ,在體外適宜的培養(yǎng)條件下可以無限增殖, 進(jìn)而分化為多種功能細(xì)胞及組織器官。當(dāng)代科學(xué)家普遍認(rèn)為, 人類干細(xì)胞的研究將為再生醫(yī)學(xué)提供廣闊的應(yīng)用前景 。特別是在組
織工程學(xué)方面,干細(xì)胞被認(rèn)為可以解決長期困擾臨床的器官不足和免疫排斥的難題, 從而實(shí)現(xiàn)人類用人工培養(yǎng)的組織和器官替代或更換疾病組織和器官的目標(biāo)。

干細(xì)胞研究及其相關(guān)臨床應(yīng)用在為人類帶來巨大利益的同時(shí) ,也存在著生物危害的潛在安全隱患。例如 ,無論用于基礎(chǔ)研究還是臨床治療 ,都必須經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室干細(xì)胞分離 、培養(yǎng) 、定向誘導(dǎo)分化甚至基因操作, 體內(nèi)研究還涉及細(xì)胞的移植和體內(nèi)示蹤等較為復(fù)雜和耗時(shí)的過程 ,在干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室操作中 ,存在來自干細(xì)胞的內(nèi)源性的和操作過程中外源性的生物危害風(fēng)險(xiǎn)。
一　內(nèi)源性污染
1　內(nèi)源性污染的來源
內(nèi)源性污染主要是從干細(xì)胞的來源來考慮的 。目前, 在干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究和臨床治療研究中 ,首要來源是自體干細(xì)胞;其次是異體干細(xì)胞 ;此外 , 還有經(jīng)過特殊培養(yǎng)的動物來源的干細(xì)胞等 。所謂干細(xì)胞的內(nèi)源性污染,著重強(qiáng)調(diào)的是細(xì)胞自身所攜帶傳染性疾病以及遺傳性疾病的問題。
二 外源性污染
1　外源性污染的來源
外源性污染 ,通常是指外源性微生物污染 ,包括細(xì)菌、支原體 、真菌和病毒污染等。細(xì)菌感染較為多見的是大腸桿菌 、金黃色葡萄球菌、假單胞菌屬等 ;常見的支原體污染包括以下幾種:人源支原體通常由實(shí)驗(yàn)人員帶入 (如口腔支原體 、人支原體、唾液支原體);動物來源的支原體通常經(jīng)牛血清帶入 (發(fā)酵支原體 、精氨酸支原體 、萊氏支原體 );豬鼻支原體(分離自豬)可能經(jīng)胰蛋白酶 (在分離 、消化細(xì)胞時(shí)使用)帶入。
外源性污染可能的途徑有:①細(xì)胞分離和處理過程。細(xì)胞在操作和儲存的過程中面臨著嚴(yán)峻的細(xì)菌和支原體污染威脅 。病毒污染有可能是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中偶然帶入病毒 ,如利用病毒建立細(xì)胞系或者利用病毒誘導(dǎo)編碼目的蛋白基因的表達(dá), 使用被病毒污染的生物制品如動物血清組分 、胰蛋白酶等,在操作過程被實(shí)驗(yàn)人員攜帶病毒污染。 ②許多干細(xì)胞的長期培養(yǎng)需要動物 (如小鼠 )基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞來支持生長 ,導(dǎo)致一些已知或未知的動物源性病原體污染 。多年的體外細(xì)胞培養(yǎng) 、骨髓細(xì)胞移植及組織器官移植等經(jīng)驗(yàn)告訴我們, 微生物污染處處存在。因此 ,在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中以及實(shí)驗(yàn)前后 ,對微生物污染進(jìn)行嚴(yán)格的檢測顯得尤為重要。
2.外源性污染的危害
與內(nèi)源性污染相比 ,外源性污染具有污染途徑多、防控更為復(fù)雜的特點(diǎn) 。所以, 是否能夠在每個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格把關(guān),防止外源性污染的發(fā)生,保證干細(xì)胞的質(zhì)量 ,對于干細(xì)胞研究和臨床治療研究起著決定性作用 。如果外源性污染控制不力 ,除了加重病情 ,預(yù)期臨床治療失敗以外 ,污染的病毒如果整合到受體的 DNA內(nèi) ,甚至可能導(dǎo)致腫瘤的意外發(fā)生。
三 外源性污染的防控措施
相對于內(nèi)源性污染防控 ,外源性污染的防控更加重要，重在加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的操作規(guī)范。

1. 規(guī)范干細(xì)胞風(fēng)險(xiǎn)評估體系 　
為了完善干細(xì)胞操作的風(fēng)險(xiǎn)評估體系 , 首要任務(wù)是建立一個(gè)各種類型干細(xì)胞模型的操作分級標(biāo)準(zhǔn) ，詳細(xì)備案分離、增殖 、分化各種來源干細(xì)胞的操作步驟和實(shí)驗(yàn)方案, 這有助于對微生物污染的來源 (人、試劑、器材等 )進(jìn)行判斷。
2. 建立系統(tǒng)的病原微生物檢測方法 　
細(xì)菌的檢測首先通過觀察細(xì)胞培養(yǎng)上清的顏色變化, 當(dāng)發(fā)生細(xì)菌污染時(shí) ,短期內(nèi)培養(yǎng)液顏色變黃 ,表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生 ,有時(shí)可出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象;其次在倒置顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮,有時(shí)在細(xì)胞表面和周圍有大量細(xì)菌存在 ,細(xì)胞生長停止并有中毒表現(xiàn) ;也可通過培養(yǎng)液涂片染色檢查初步確定細(xì)菌種類 ;或者通過肉湯培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)予以鑒定 。
四．一種來自歐盟的干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室控制方案
干細(xì)胞研究中的安全問題技術(shù)性很強(qiáng), 也許我們永遠(yuǎn)無法徹底消除其不同層面、不同來源的安全性隱患。從防控角度來講，外源性的污染要比內(nèi)源性的更加重要，那么有沒有一種有效防控外源性污染的方法呢？一種來自歐盟的實(shí)驗(yàn)室方式，歐菲姆電源式過氧化氫空間干霧滅菌系統(tǒng)有效解決這一問題。
1. 設(shè)備原理
　 電源式干霧滅菌系統(tǒng)是使用電源帶動（無須使用壓縮空氣），利用文丘里原理高速吸入空氣，在噴頭內(nèi)給空氣足夠大的動能。讓氣體高速與消毒液碰撞產(chǎn)生直徑小于5微米的干霧顆粒。讓消毒液以干霧顆粒的形式彌散在需要滅菌的無菌潔凈區(qū)，從而達(dá)到徹底滅菌效果，可替代熏蒸。原理非常簡單，但是需要解決：瞬間提供空氣足夠高的動能讓顆粒達(dá)到均勻的3－5微米、散熱降噪、設(shè)備空間占用三大問題。而歐菲姆獨(dú)有的硼鈷合金自帶潤滑功能的器械噴頭設(shè)計(jì)，將干霧設(shè)備的功效擴(kuò)大化的同時(shí)，極大的降低了空間占用，解決了散熱，降噪的問題。
2 干霧滅菌方案構(gòu)成
諾福特效殺孢子劑 + 歐菲姆干霧滅菌設(shè)備
干霧滅菌方案可安全用于P2以上級別的：無菌實(shí)驗(yàn)室、微生物室環(huán)境消毒滅菌。
諾福特效殺孢子劑的特點(diǎn)：
①殺菌效力廣譜高效：同時(shí)殺滅200多種微生物。30分鐘對黑色枯草芽孢、嗜熱脂肪芽孢桿菌均能穩(wěn)定達(dá)到6個(gè)對單位殺滅率。
②歐盟進(jìn)口，無味、無毒，對人體、環(huán)境安全。歐盟醫(yī)療食品安全認(rèn)證。
③驗(yàn)證資料齊全：可提供殺菌效力驗(yàn)證；殘留驗(yàn)證；材料兼容性驗(yàn)證三項(xiàng)驗(yàn)證的詳細(xì)資料，可提供驗(yàn)證模版。

3.歐菲姆干霧滅菌設(shè)備的特點(diǎn)
①全球領(lǐng)先的霧化技術(shù)。干霧微粒均勻達(dá)到3－5微米。面積完全覆蓋。殺菌時(shí)間超短，1.5-3個(gè)小時(shí)可完成整個(gè)滅菌流程，保證實(shí)驗(yàn)室空間安全。
②體積小、重量輕（凈重5.8KG），可方便使用大空間潔凈區(qū)（多點(diǎn)布置），和小空間無菌室滅菌。電源連接，方便移動。

結(jié)論：干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，外源性的污染防控比內(nèi)源性污染更復(fù)雜，一種來自歐盟的技術(shù)，能有效減少外源風(fēng)險(xiǎn)。 建議在風(fēng)險(xiǎn)評估研究和技術(shù)革新的基礎(chǔ)上, 制定和完善我國干細(xì)胞和細(xì)胞研究生物安全管理的體系和法律法規(guī) ,有效保證我國干細(xì)胞研究與應(yīng)用的健康發(fā)展。