如何測(cè)定微透析探針的回收率

微透析技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的動(dòng)態(tài)生物取樣技術(shù)，具有“活體、微創(chuàng)、實(shí)時(shí)、高效”等特點(diǎn)，其與現(xiàn)代分析技術(shù)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了連續(xù)取樣和動(dòng)態(tài)測(cè)定，可進(jìn)行微量的定性、定量分析。微透析探針回收率的準(zhǔn)確校正，是測(cè)定生物體中待測(cè)組分確切濃度的關(guān)鍵步驟，可提高大分子、難溶性物質(zhì)的回收率，使微透析的應(yīng)用更為廣泛。

一.微透析技術(shù)的原理:

物質(zhì)沿濃度梯度擴(kuò)散和半透膜對(duì)小分子化合物具有通透性，將微透析探針置于組織中，當(dāng)灌流液通過(guò)探針時(shí)，細(xì)胞外液中相對(duì)分子質(zhì)量合適的物質(zhì)便會(huì)順濃度梯度通過(guò)半透膜進(jìn)入灌流液中。由于透析管中的灌流液不斷流動(dòng)更新，因此，跨膜濃度梯度始終存在，微透析得以持續(xù)進(jìn)行。

二.回收率的測(cè)定方法

1 體外校正體外校正實(shí)驗(yàn)是把探針?lè)湃胍阎獫舛鹊臉悠啡芤褐校�按體內(nèi)微透析方法進(jìn)行操作，一段時(shí)間后收集灌流液，測(cè)定灌流液中的藥物濃度，并與溶液標(biāo)準(zhǔn)濃度相比，即得相對(duì)回收率。體外法沒(méi)有考慮體內(nèi)的生理因素對(duì)回收率得影響，所以，只有在體內(nèi)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，或只需知道藥物在體內(nèi)的變化而不要求絕對(duì)含量時(shí)，體外校正才滿足要求。

2體內(nèi)校正相對(duì)回收率可以進(jìn)行體外校正(in vitro calibration)和體內(nèi)校正(invivo calibration)，在血液或膽汁微透析實(shí)驗(yàn)中，因?yàn)樗幬镌谄渲袛U(kuò)散速度快，不影響探針的收率，所以只進(jìn)行體外校正即可;而在一些實(shí)體組織中，如腦、肝臟、肌肉等，通常山于取樣部位的曲度增加導(dǎo)致擴(kuò)散距離變長(zhǎng)，擴(kuò)散空間變小10]，使得藥物在其中的擴(kuò)散比通過(guò)半透膜慢，回收率下降，因此必須進(jìn)行體內(nèi)校正。一般體內(nèi)校正的方法有如下幾種:

2.1內(nèi)標(biāo)法(Internal technique)是在灌流液中加入一已知濃度且性質(zhì)與被分析物質(zhì)相似的另一種物質(zhì)（一般為結(jié)構(gòu)類似的化合物）做內(nèi)標(biāo)物，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)求得藥物和內(nèi)標(biāo)的回收率比，并且假設(shè)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，兩者的回收率比不發(fā)生變化，通過(guò)測(cè)定內(nèi)標(biāo)在體內(nèi)的相對(duì)回收率來(lái)計(jì)算藥物的回收率。

2.2反透析法(Retrodialysis)是把已知量的藥物加入灌流液中，一段時(shí)間后測(cè)定透析液中的藥物濃度。應(yīng)用反向透析法校正微透析探針回收率的前提條件是探針的回收率和傳遞率相等。

2.3釋放量法(Delivery)是反透析法的一種改良方法，也可認(rèn)為是零凈通量法的簡(jiǎn)化形式，可以克服應(yīng)用一種類似物作內(nèi)標(biāo)所引入的不確定因素。是在實(shí)驗(yàn)前測(cè)定待測(cè)化合物向體內(nèi)靶組織釋放量，釋放量即等于回收率，并在在實(shí)驗(yàn)完成后，重新測(cè)定釋放量，以證實(shí)探針行為在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有改變，該方法簡(jiǎn)單、方便"

2.4 零凈通量法(ZNF , zero net flux)配制一系列不同濃度藥物的灌流液進(jìn)行微透析實(shí)驗(yàn)，如果細(xì)胞外液中的藥物濃度大于灌流液中的濃度，藥物會(huì)沿濃度梯度進(jìn)入探針，反之，藥物會(huì)沿濃度梯度進(jìn)入組織。當(dāng)兩者濃度相等時(shí)，就沒(méi)有藥物的凈擴(kuò)散。這時(shí)以藥物在灌流液中的濃度為橫坐標(biāo)，藥物的濃度變化為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果應(yīng)為一直線，與橫軸的交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的濃度即為組織中的濃度，斜率為相對(duì)回收率2].。動(dòng)態(tài)零凈通量法（Dynamic ZNF)“13是零凈通量法（ZNF）的改進(jìn)形式，是將一種濃度的灌注液灌注到3-4個(gè)受試者體內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在不同的時(shí)間點(diǎn)將其近似視為穩(wěn)態(tài)從而連續(xù)進(jìn)行零凈量法測(cè)定，耗時(shí)且探針消耗比較大。曾被運(yùn)用到檢測(cè)P-糖蛋白對(duì)司帕沙星隊(duì)腦分布的影響""

2.5外推至零流量法(Extropolation to zero flow rate)是通過(guò)測(cè)定在不同灌流速度條件下微透析液中待測(cè)化合物的濃度，用所測(cè)得濃度對(duì)相應(yīng)灌流速度進(jìn)行非線性回歸，通過(guò)外推至零流速獲得探針周?chē)鷺悠坊�質(zhì)中待測(cè)化合物濃度的估計(jì)值。

2.6慢灌流法(Slow perfus ion method)是根據(jù)外推至零流量法的原理發(fā)展而來(lái)的,相對(duì)回收率隨灌流速度的增加而降低,當(dāng)灌流速度小于50nL-min'、相對(duì)分子質(zhì)量小于500時(shí)，相對(duì)回收率將大于95% ，此時(shí)，引入的回收率誤差可以忽略。此方法對(duì)分析儀器提出了極高的要求。

除了上述介紹的定量的方法之外還有:內(nèi)源性參照物的方法0或者是數(shù)學(xué)模型u]。迄今為止，微透析活體分析的定量難以令人十分滿意，每種定量方法都有其不盡如人意之處，因此在選用測(cè)定回收率才的方法時(shí),應(yīng)視具體試驗(yàn)情況而定，使所測(cè)定的結(jié)果盡可能準(zhǔn)確可靠。

近年來(lái)人們?cè)絹?lái)越關(guān)注微透析在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，雖然自微透析技術(shù)自問(wèn)世20多年以來(lái),取得了很大的發(fā)展，尤其是對(duì)回收率的定量方面,使微透析技術(shù)對(duì)許多難溶性,大分子物質(zhì)也實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)、在線監(jiān)測(cè)。但是每種定量方法都有其不足且尚有很多藥物不適合進(jìn)行微透析試驗(yàn)，因此，使微透析的結(jié)果具有準(zhǔn)確、可重復(fù)性,擴(kuò)大微透析的適用范圍還需要進(jìn)一步努力。

微透析是一種從生物活體內(nèi)進(jìn)行動(dòng)態(tài)微量生化取樣的新技術(shù)，能對(duì)大鼠、小鼠、兔子、羊、狗、猴等大小型動(dòng)物的血液、腦、眼睛、心臟等組織區(qū)域進(jìn)行微透析取樣，具有活體連續(xù)取樣、動(dòng)態(tài)觀察、定量分析、采樣量小、組織損傷輕等特點(diǎn)，可運(yùn)用于精神藥物、生理學(xué)、藥理學(xué)、生命胺分析、藥物分析等研究領(lǐng)域。

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