多重naica®數(shù)字PCR法在同時(shí)監(jiān)測水質(zhì)中多種細(xì)菌種類和計(jì)數(shù)的應(yīng)用

導(dǎo)讀

在現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖中，水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)是為魚類或其他物種的集約養(yǎng)殖而設(shè)計(jì)，其水質(zhì)直接影響魚類的健康和生產(chǎn)，而微生物在去除有機(jī)物和氮循環(huán)、有毒硫化氫(H₂S)的產(chǎn)生方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，微生物種類和數(shù)量會直接影響魚類的健康，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)特定種類的細(xì)菌對控制潛在風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要，尤其是那些對養(yǎng)殖魚類及其最終消費(fèi)者具有致病性的細(xì)菌。因此亟需高精度、高特異性、高敏感性且快速的方法，監(jiān)測特定種類的細(xì)菌和數(shù)量。

挪威海洋科技研究中心SINTEF Ocean科學(xué)家建立基于naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的多重?cái)?shù)字PCR絕對定量評估鮭魚三種關(guān)鍵病原體、人病原體單核增生李斯特菌、影響鮭魚生存環(huán)境的硫酸鹽還原菌(SRB)，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的相關(guān)優(yōu)勢細(xì)菌進(jìn)行監(jiān)測。

該方法在發(fā)表于《Journal of Microbiological Methods》雜志上，題為“Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR”。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

▶  使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)直接絕對定量水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中五種細(xì)菌。

▶  開發(fā)同時(shí)定量水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)檢測相關(guān)五種細(xì)菌的多重?cái)?shù)字PCR檢測方法。

▶  基于naica^®微滴芯片數(shù)字PCR檢測方法具有靈敏度高、特異性高、耗時(shí)少的優(yōu)勢。

科學(xué)家建立數(shù)字PCR方法監(jiān)測與鮭魚養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中三類不同的細(xì)菌：

第一類：魚類病原體，與魚類的潰瘍性疾病有關(guān)的粘放線菌Moritella viscosa，會引起腸性紅嘴病的魯氏耶爾森菌Yersinia ruckeri以及與魚類的細(xì)菌性冷水病有關(guān)的黃桿菌Flavobacterium psychrophilum。

第二類：人類病原體，可以從海產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到消費(fèi)者身上的人病原體，單核增生李斯特菌Listeria monocytogenes。

第三類：破壞魚類生長環(huán)境的細(xì)菌。通常硫酸鹽還原細(xì)菌（SRB）在厭氧條件下通過將硫酸鹽（SO42-）轉(zhuǎn)化為有毒的硫化氫（H2S）來影響魚類健康�？赏ㄟ^以脫硫弧菌Desulfovibrio desulfuricans為參考菌株進(jìn)行SRB檢測。

研究學(xué)者利用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的單重和多重檢測方法對上述優(yōu)勢菌種進(jìn)行絕對定量。結(jié)果表明粘放線菌Moritella viscosa，魯氏耶爾森菌Yersinia ruckeri，黃桿菌Flavobacterium psychrophilum檢出限低至20fg，李斯特菌Listeria monocytogenes和脫硫弧菌Desulfovibrio desulfuricans DNA檢測含量可低至2fg，均具有更寬的線性范圍，線性擬合度R²均在0.999以上（圖1）。多重naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測結(jié)果與單重分析中檢測到的目標(biāo)基因濃度吻合（圖2，圖3）。此次研究充分證明了naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)可以同時(shí)精確定量復(fù)雜水質(zhì)樣品中多種類細(xì)菌。

▲圖1：naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)定量5種細(xì)菌的線性回歸圖，分別給出相應(yīng)的方程和回歸系數(shù)。

▲圖2：對魯氏耶爾森菌Yersinia ruckeri（A）黃桿菌Flavobacterium psychrophilum（B）的單、雙重分析結(jié)果進(jìn)行比較。在MMC-DNA背景(1 ng/μl)中添加魯氏耶爾森菌Yersinia ruckeri ，黃桿菌Flavobacterium psychrophilum gDNA，10倍稀釋后進(jìn)行基因拷貝數(shù)定量。

▲圖3：在1 ng/μl MMC-DNA背景下，單重(圓形)和三重(三角形)測定的靶基因拷貝濃度繪制。恒等線表示每個(gè)點(diǎn)的X坐標(biāo)和y坐標(biāo)相等的位置。
 

原文鏈接如下：http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

挪威海洋科技研究中心SINTEF Ocean為全球開展的海洋相關(guān)科學(xué)研究和創(chuàng)新，致力于海洋技術(shù)、生物標(biāo)記和海洋環(huán)境技術(shù)研究。