生物酶解處理對(duì)甲醇蛋白細(xì)胞破壁的影響

甲醇蛋白是以甲醇、磷酸等作為培養(yǎng)基，通過(guò)發(fā)酵形成的甲醇酵母細(xì)胞為單細(xì)胞菌體，再經(jīng)提煉形成單細(xì)胞蛋白。從甲醇酵母細(xì)胞中所提取的單細(xì)胞蛋白產(chǎn)品安全無(wú)毒，其豐富的氨基酸含量是其他植物性原料所無(wú)法比擬的，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。單細(xì)胞甲醇蛋白胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)占細(xì)胞總蛋白質(zhì)的比例達(dá) 95%以上。但是甲醇酵母細(xì)胞是由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質(zhì)等組成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且胞壁較厚，結(jié)構(gòu)堅(jiān)韌，所以大部分并沒(méi)有破壁，不利于胞內(nèi)蛋白質(zhì)提取。如果將其直接進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，收率很低。而且提取物里面還含有大量的磷脂、核酸和多糖等雜質(zhì)。因此，目前這類(lèi)甲醇蛋白粗品主要作為飼料添加劑使用。
   本文利用甲醇蛋白粗品經(jīng)過(guò)堿溶、離心、破壁、酸沉制取純化甲醇蛋白，研究了適合于甲醇酵母細(xì)胞破壁及純化胞內(nèi)蛋白質(zhì)的方法，為甲醇蛋白的有效利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

儀器和原料
    高壓均質(zhì)機(jī)NanoDeBEE(蘇州微流納米生物技術(shù)有限公司);Q/SGYM1008電子天平;BD-1A-70冷凍干燥機(jī);Delta320酸度計(jì):梅特勒－托利多公司;TDL-5A離心機(jī);DKS24恒溫水浴鍋;SHA－B水浴恒溫振蕩器。甲醇蛋白粗品:粗蛋白質(zhì)50% 粗脂肪11.5%粗纖維7.4%水分18.5%粗灰分12.6%；酵母破壁酶（廣西南寧龐博生物工程有限公司）;其他試劑均為分析純。

試驗(yàn)方法
   1.生物酶解處理：量取25%甲醇蛋白粗品溶液500mL，調(diào)節(jié)pH4.5后分裝成5份，每份100mL。在甲醇蛋白粗品溶液中分別加入0.01%、0.02%、0.03%、0.04%和0.05%的酵母破壁酶，在水浴恒溫振蕩器中50℃保溫12h。酶解結(jié)束后，測(cè)定細(xì)胞破壁率，然后離心收集上清液，并測(cè)定其中蛋白質(zhì)含量。
   2.熱堿處理：量取5份25%甲醇蛋白粗品溶液各100mL，調(diào)節(jié)pH至7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，分別置于60℃的恒溫水浴中保溫2h，每隔10min攪拌1次。熱堿處理結(jié)束后，測(cè)定細(xì)胞破壁率，然后離心收集上清液，并測(cè)定其中蛋白質(zhì)含量。
   3.高壓均質(zhì)處理。量取5份25%甲醇蛋白粗品溶液各100mL，在高壓均質(zhì)機(jī)中進(jìn)行高壓均質(zhì)破壁，高壓均質(zhì)壓力分別為80、120、160、200和240MPa。高壓均質(zhì)處理結(jié)束后，測(cè)定細(xì)胞破壁率，然后離心收集上清液，并測(cè)定其中蛋白質(zhì)含量。
   4.熱堿－均質(zhì)處理：量取2份25%甲醇蛋白粗品溶液各200mL，調(diào)節(jié)pH至9.0、10.0后，分別置于60℃的恒溫水浴中保溫2h進(jìn)行熱堿處理。熱堿處理結(jié)束后分裝成4份，每份100mL，分別在80、120、160、200和240MPa下進(jìn)行均質(zhì)處理。均質(zhì)結(jié)束后，測(cè)定細(xì)胞破壁率，然后離心收集上清液，并測(cè)定其中的蛋白質(zhì)含量。
   5.甲醇蛋白酸沉純化:最取5份500mL25%甲醇蛋白粗品溶液，選擇適合甲醇蛋白細(xì)胞破壁處理方法，處理結(jié)束后離心收集上清液，用鹽酸分別將上清液調(diào)節(jié)pH至3.0、3.5、4.0、4.5和5.0，靜置20min后，5000r/min下離心10min，即獲得蛋白沉淀。將蛋白沉淀冷凍干燥后稱(chēng)重，并測(cè)定蛋白沉淀中粗蛋白質(zhì)含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
   酵母破壁酶是由β－葡聚糖酶、甘露聚糖酶及幾丁質(zhì)酶等復(fù)配而成，可降解細(xì)胞壁多糖，使胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放出來(lái)。圖1為生物酶解處理對(duì)甲醇蛋白細(xì)胞破壁效果的影響曲線。
                    
                                圖1生物酶解處理對(duì)甲醇蛋白細(xì)胞破壁的影響
   從圖1可以看出，隨酶用量增加，甲醇蛋白細(xì)胞破壁率不斷上升，酶用量在0.01%～0.04%時(shí)，細(xì)胞破壁率快速上升，蛋白釋放量也迅速增加。但當(dāng)酶用量大于0.04%時(shí)，上升趨勢(shì)減緩，蛋白釋放量增加不明顯。但總體來(lái)看，生物酶解處理對(duì)酵母細(xì)胞破壁效果較差，最大破壁率僅約22%，蛋白釋放量也較低。
                      
                                圖2熱堿處理對(duì)甲醇蛋白細(xì)胞破壁的影響
   從圖2可以看出，pH低于8.0時(shí)，破壁效果較差。當(dāng)pH升高，細(xì)胞破壁率迅速上升，在pH11.0時(shí)，細(xì)胞破壁率高達(dá)36.2%。蛋白釋放量與細(xì)胞破壁率變化趨勢(shì)一致。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)甲醇蛋白粗品溶液熱處理時(shí)間延長(zhǎng)及堿性增強(qiáng)時(shí)，純化蛋白顏色也不斷加深，并伴隨有硫化物的特殊氣味，這可能是由于胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放出來(lái)后，部分二硫鍵斷裂，與堿反應(yīng)變性所致。當(dāng)均質(zhì)壓力增大至160MPa，細(xì)胞破壁率快速上升，蛋白釋放量也迅速增加。 
   結(jié)果表明，熱堿與高壓均質(zhì)聯(lián)合處理法較生物酶解處理法、熱堿處理法及高壓均質(zhì)處理法對(duì)細(xì)胞破壁效率高。綜合生產(chǎn)成本及提純蛋白的用途和性質(zhì)等因素，本研究獲得了熱堿－均質(zhì)處理的最適條件:采用Ph10.0，60℃熱處理2h，160MPa壓力均質(zhì)3次，細(xì)胞破壁率可達(dá)97.6%;在pH4.5時(shí)，破壁后上清液蛋白沉淀量最大，所得純化甲醇蛋白中粗蛋白質(zhì)含量達(dá)到82.5%，純化效果較為理想。