PROTAC常規(guī)的靶點選擇與設(shè)計
前文我們已經(jīng)介紹過，PROTAC 分子由靶蛋白配體、E3 連接酶配體和兩者中間的連接段組成，設(shè)計 PROTAC 之初，三者應(yīng)該分別考量。
■ 靶蛋白配體
在實際設(shè)計工作中，往往先會選擇好目標(biāo)蛋白。靶蛋白的挑選可以從以下幾點考慮：
1、該蛋白是否具有特異性, 非特異性蛋白會造成脫靶毒性；
2、該蛋白是否屬于 PROTAC 分子常規(guī)的降解蛋白 (PROTACable 靶點增加 PROTAC 設(shè)計的有效性), 2021 年，Nature Reviews Drug Discovery 雜志報導(dǎo)了一篇利用 PROTACtability 方法評價蛋白靶點的可PROTACable的文章，文章最后提出值得 PROTAC 化的靶點包括了激酶 (MEK、KRAS、CDK 和 Bcr/Abl)、轉(zhuǎn)錄因子 (如 p53、STAT、RAR、ER 和 AR)、表觀遺傳因子 (如 HDAC 和 BET 溴結(jié)構(gòu)域)和 E3 連接酶本身 (如 MDM2) 等。
3、該蛋白是否有相關(guān)的配體或晶型報道，這是考慮到商業(yè)化設(shè)計 PROTAC 的效率性，如目前臨床二期的兩個已知結(jié)構(gòu)的 ARV-471和 ARV-766 結(jié)構(gòu)分別源自于 Tamoxifen 和 (+)-JQ-1。
上述三點均滿足時，常規(guī)的 PROTAC 設(shè)計便可進行：從靶點已知的相關(guān)配體分子構(gòu)效關(guān)系總結(jié)出它不影響結(jié)合的適合改造的位置，或是有蛋白的晶體模型可被用于虛擬篩選從而縮小后續(xù)高通量篩選的范圍。
當(dāng)然，在實際設(shè)計中，往往還會遇到靶蛋白本身的內(nèi)源性配體：多肽、DNA、糖鏈等，基于此也有相關(guān)的 p-PROTAC 被開發(fā) (多肽-PROTAC)，筆者認(rèn)為基于肽段的 PROTAC 可能是該項技術(shù)發(fā)展的一個方向：目前傳統(tǒng) PROTAC (小分子為主) 需要前期配體的構(gòu)效關(guān)系研究以確定基礎(chǔ)決定連接位置，但單純用蛋白本身的多肽配體則不需要這個，大多數(shù)多肽可連接的位置在 C 端或者 N 端。
當(dāng)然，若是從頭設(shè)計 PROTAC (沒有成熟配體報道的靶蛋白)，要考慮的就不僅僅是上述問題了，結(jié)合腔、突變、其它變構(gòu)位點、可逆共價結(jié)合等種種因素都需要深入研究，總結(jié)起來則是一個藥化課題的體量。
■ E3 連接酶配體
首先，來看 E3 連接酶配體，對于 E3 連接酶配體目前常規(guī)使用的還是 CRBN 和 VHL 兩種配體。從流程上來講，原則上需要通過 E3 連接酶試劑盒的確定靶細(xì)胞中 E3 連接酶的豐度，從而選擇最佳的 E3 連接酶配體。但目前這一塊目前的研究涉及仍然不是很多，一般而言，商業(yè)化的設(shè)計只是選擇經(jīng)濟易得的 CRBN 和 VHL 配體分子。
圖 3. 常見的 E3 連接酶及其配體[6]
隨著對 PROTAC 技術(shù)的深入研究，目前對 E3 泛素連接酶配體的篩選也開始進入科學(xué)家視野。在 “三元降解復(fù)合分子” 的模式下，也出現(xiàn)了比如基于 RNA 酶的 RIBOTAC (其功能是將目標(biāo) RNA “帶到” RNase進行降解)、基于溶酶體的 ATTEC (既可以與自噬過程中的關(guān)鍵蛋白 LC3 結(jié)合，也可以與靶蛋白結(jié)合，將靶蛋白綁定至自噬小體進行降解)、LYTAC（干貨丨藥界新寵—— LYTAC 與靶向蛋白降解技術(shù)) 和自噬介導(dǎo)的降解劑 AUTAC 等，它們補充了 PROTAC 的降解范圍，使靶向降解可以作用于更多方面。結(jié)構(gòu)上設(shè)計思路不變，只是對 E3 連接酶配體做相應(yīng)的替換。
圖 4. 利用 RNA 酶靶向降解 ROI 的 RIBOTAC[7]
a. RIBOTAC 是一個二價分子，包含 RNA 結(jié)合模塊 (紫色)，核糖核酸酶 (RNase) 招募模塊(藍(lán)色)和一個連接子 (粉線); RIBOTAC一旦與靶 RNA 結(jié)合，就會在靶 RNA 附近招募 RNase，從而促進其降解。b. PROTAC 降解機制。
■ Linker 分子
最后讓我們看看看似簡單的 Linker 分子。初步的 PROTAC 設(shè)計常常會選擇 PEG 鏈作為連接分子。PEG 鏈具有足夠的柔性，可以調(diào)整分子到適宜的結(jié)合角度，但也正由于 PEG 鏈的柔性，讓分子的結(jié)合熵過高，這一點在后期的優(yōu)化中需要將之改善。
Linker 的設(shè)計目前沒有成熟的方案，通過對目前報道和臨床已知的 PROTAC 統(tǒng)計，大部分 Linker 所用原子的鏈長常在 10~20 個原子長度。另外也有研究通過歸一化分析，總結(jié)了鏈長與降解活性的關(guān)系，從下圖中大致可以看出：較長的鏈長由于更高的熵而使活性降低，但相較于較低鏈長導(dǎo)致的無法有效拉近配體兩端分子距離這一結(jié)果，它的影響較小。所以分子設(shè)計初期一般會選擇稍長的 Linker 鏈。
具體問題需要具體分析，Linker 的選擇不但與蛋白結(jié)合域的深度相關(guān)，也會對配體與蛋白的結(jié)合以及整體 PROTAC 的物理性質(zhì)造成影響。在 PROTAC 的后期優(yōu)化中，它往往是考察的重點。
誠然，經(jīng)過以上幾步合理設(shè)計后雖然可以初步構(gòu)建一個 PROTAC 分子，但它并不一定具有活性，任何藥物的設(shè)計都不是一蹴而就，而是實驗驗證與總結(jié)設(shè)計螺旋上升的過程。在后期的結(jié)構(gòu)優(yōu)化分析原因時，仍然需要綜合考量每一步設(shè)計中選擇的分子、連接位點的合理性以及整體 PROTAC 的透膜性等問題。
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| PROTAC |
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是一種高效的，選擇性的，細(xì)胞透過的基于 PROTAC 技術(shù)的 BET 降解劑，IC50 值為 14 nM，具有抗腫瘤活性。 |
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是一種基于 PROTAC 技術(shù)的有效的 K-Ras 降解劑，在 SW1573 中對 K-Ras 降解率 ≥ 70%。 |
| SNIPER |
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由 IAP 拮抗劑 LCL-161 衍生物和 BET 抑制劑 (+)-JQ-1，通過 linker 連接組成，誘導(dǎo) BRD4 降解。SNIPER (BRD)-1 同時抑制 cIAP1，cIAP2 和 XIAP，IC50 分別為 6.8 nM，17 nM 和 49 nM。 |
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由 Dasatinib (ABL 抑制劑) 通過 linker 與 Bestatin (cIAP1 配體) 組合而成，可有效降解 BCR-ABL 蛋白。 |
| Protac-linker conjugate for PAC |
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PROTAC BRD4 Degrader-5-CO-PEG3-N3 是一種用于 PAC 的 PROTAC-linker 偶聯(lián)物，包含 BRD4 降解劑 GNE-987 和 3 個 PEG 的 linker。 |
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由 ADC linker 和 PROTAC 分子組成，PAC 與抗體偶聯(lián)。與 PROTAC (不偶聯(lián) Ab) 相比，PAC 偶聯(lián)抗體之后更加顯著降低雌激素受體-α (ERα) 水平。 |
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PROTAC BRD4 degrader for PAC-1 是一種用于 PAC 的 PROTAC-linker 偶聯(lián)物，包含嵌合體 BET 降解劑 GNE-987 和含二硫化物的 linker。 |
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參考文獻
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4. Jin J, Wu Y, Chen J, Shen Y, Zhang L, Zhang H, Chen L, Yuan H, Chen H, Zhang W, Luan X. The peptide PROTAC modality: a novel strategy for targeted protein ubiquitination. Theranostics. 2020 Aug 8;10(22):10141-10153.
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6. Zhong Y, Chi F, Wu H, Liu Y, Xie Z, Huang W, Shi W, Qian H. Emerging targeted protein degradation tools for innovative drug discovery: From classical PROTACs to the novel and beyond. Eur J Med Chem. 2022 Jan 20;231:114142.
7. Costales MG, Suresh B, Vishnu K, Disney MD. Targeted Degradation of a Hypoxia-Associated Non-coding RNA Enhances the Selectivity of a Small Molecule Interacting with RNA. Cell Chem Biol. 2019 Aug 15;26(8):1180-1186.e5.
8. Bemis TA, La Clair JJ, Burkart MD. Unraveling the Role of Linker Design in Proteolysis Targeting Chimeras. J Med Chem. 2021 Jun 24;64(12):8042-8052.
