naica®數(shù)字PCR系統(tǒng)在霍亂弧菌復(fù)制關(guān)鍵基因定量檢測驗證的應(yīng)用

導(dǎo)讀

霍亂弧菌是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表現(xiàn)為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，死亡率甚高，屬于國際檢疫傳染病。了解霍亂弧菌的復(fù)制原理能夠幫助人們更系統(tǒng)的探索其感染機制。

法國巴斯德研究所及華沙大學(xué)細菌遺傳學(xué)系的科學(xué)家們在國際知名雜志Nucleic Acids Research上發(fā)表了一篇學(xué)術(shù)論文，揭示了霍亂弧菌的復(fù)制機制。（IF=16.971）

應(yīng)用亮點：

▶  揭示了霍亂弧菌的兩條染色體的復(fù)制協(xié)調(diào)機制。

▶ 通過naica®微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)對霍亂弧菌復(fù)制的關(guān)鍵調(diào)控基因進行定量檢測并驗證猜想。

▶  該研究發(fā)現(xiàn)的霍亂弧菌復(fù)制機制可能存在于所有弧菌科物種中，對于其他弧菌復(fù)制研究具有參考意義。

研究背景：

霍亂弧菌是引起霍亂的病原菌，它由兩條染色體（Chr1、Chr2）以精心編排的順序進行復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)只有在Chr1上的crtS 位點復(fù)制后才會觸發(fā)Chr2啟動。本研究提供了關(guān)于 crtS 如何觸發(fā)Chr2復(fù)制起始的新思路，對Chr1-Chr2復(fù)制協(xié)調(diào)機制進行了深入探討。

研究成果：

❶、crtS（位于Chr1上，啟動子結(jié)合位點）和39m位點（位于Chr2上，啟動子結(jié)合位點）通過與啟動子RctB競爭結(jié)合影響Chr2的復(fù)制，crtS的存在降低了RctB與39m的結(jié)合。

▲crtS 能夠抵消39m位點的抑制作用。Chr2復(fù)制起點 (ori2)和39m 位點的序列比對。RctB結(jié)合位點以綠色（iterons，啟動子結(jié)合位點）和紅色（39m）表示。

❷、RctB分為4個結(jié)構(gòu)閾，研究發(fā)現(xiàn)其通過相同的DNA結(jié)合域與crtS和39m相互作用。進一步研究表明RctB域IV對于ori2（Chr2）起始位點的39m和crtS調(diào)節(jié)都是不可或缺的，并且RctB域IV的C端對于crtS協(xié)調(diào)兩條染色體的復(fù)制至關(guān)重要。

基于該調(diào)控模型，文章使用naica®微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)（Stilla Technologies）對霍亂弧菌中的（ori1 /ori2）和對照大腸桿菌中的（oriC / pORI2）進行定量，同時使用naica®多重數(shù)字RT-dPCR (Stilla Technologies) 對來自指數(shù)生長培養(yǎng)物 (OD600 0.4) 的霍亂弧菌中的 RctB mRNA 進行了定量并證實了上述猜想的正確性。

▲B、 pORI2 相對于大腸桿菌菌株染色體的拷貝數(shù) (CN)，通過在 rctB 中插入終止密碼子構(gòu)建各種 pORI2缺失表達載體。C、在有和沒有染色體 crtS 位點 (+/- crtS)的情況下，大腸桿菌中 pORI2 拷貝數(shù)的比率。D、Chr2 在非復(fù)制型霍亂弧菌中相對于 Chr1 (ori2/ori1) 的拷貝數(shù)。在所有突變體中，crtS位點被敲除，RctB結(jié)合位點被插入 Chr1 的 attTn7 插入位點（平均值±標準偏差）。

最后文章解釋了霍亂弧菌的復(fù)制機制模型：

▲crtS 協(xié)調(diào) Chr1 和 Chr2 之間復(fù)制的模型。RctB 結(jié)合位點以綠色 (iterons)、紅色 (39m) 和藍色 (crtS) 顯示。OFF = Chr1：crtS 未被復(fù)制。Chr2：與39m位點結(jié)合的RctB主要通過紅色箭頭所示來抑制ori2的復(fù)制起始。ON = Chr1：crtS 已復(fù)制。RctB與復(fù)制的crtS位點的瞬時結(jié)合導(dǎo)致與39m位點親和力降低（藍色箭頭），從而釋放ori2。RctB與甲基化iterons的結(jié)合導(dǎo)致DNA解旋元件 (DUE) 打開，RctB寡聚化到單鏈DNA上（綠色箭頭）。

期刊介紹：

Nucleic Acids Research (NAR)：1974年創(chuàng)刊，由牛津大學(xué)出版社經(jīng)過同行評審公開出版的科學(xué)期刊。期刊主要發(fā)布涉及核酸代謝和/或相互作用的核酸和蛋白質(zhì)的物理，化學(xué)，生化和生物學(xué)方面的前沿研究結(jié)果。最新影響因子16.971。