如何利用多能干細(xì)胞（PSC）培養(yǎng)類器官

在體外建立起可以準(zhǔn)確而完整模擬各種體內(nèi)器官生理學(xué)現(xiàn)象的是各位生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究者夢(mèng)寐以求的目標(biāo)，而實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)的第一步需要得到可以無(wú)限增殖，并能分化成各種組織或器官的干細(xì)胞，其可以是從成體來(lái)源或者從胚胎來(lái)源，后者相較之前者具有全能分化能力。雖然胚胎干細(xì)胞是自然界可以直接獲取全能的細(xì)胞，但是獲取難度大而且使用可能會(huì)有倫理問(wèn)題，但是隨著2006年誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）技術(shù)¹的問(wèn)世這一問(wèn)題得到很好的解決，可以讓研究人員選取任何體細(xì)胞進(jìn)行重編程后變成多能型的干細(xì)胞（PSC），然后分化成不同的成體干細(xì)胞，最后分化成各種體細(xì)胞模，特別是人多能干細(xì)胞（hPSC）可以用來(lái)分化成各種細(xì)胞，特別是無(wú)法出活體實(shí)驗(yàn)中得到的細(xì)胞。

解決了這個(gè)問(wèn)題后，新的情況出現(xiàn)了，就是2D環(huán)境下培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞往往只能貼壁在二維環(huán)境下生長(zhǎng)，但是地球上的生命都是誕生和生長(zhǎng)于三維環(huán)境中的，維度的缺失讓細(xì)胞間的相互作用力只存在XY軸，而沒(méi)有Y軸。此外，三維環(huán)境下多層細(xì)胞間的滲透效應(yīng)也缺失了。所以最終在傳統(tǒng)2D培養(yǎng)體系中細(xì)胞永遠(yuǎn)只能長(zhǎng)成細(xì)胞，很多生理學(xué)功能無(wú)法實(shí)現(xiàn)，而且無(wú)法形成類似于組織和器官的結(jié)構(gòu)。由此，將有干性細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在3D環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，使其最終能成為類似于正常組織和器官，或相應(yīng)部位腫瘤的類器官培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。常見(jiàn)的類器官培養(yǎng)方案的祖細(xì)胞來(lái)源是：成體干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，但是這種方法局限于通過(guò)活體實(shí)驗(yàn)獲取此類細(xì)胞，而且這一部分是必須在成體內(nèi)存在的，但是像心肌、腦這種無(wú)法在活體獲得成體干細(xì)胞的組織，就可以使用前面介紹的iPSC通過(guò)分化調(diào)控來(lái)獲取。在這個(gè)方面的先行者之一是美國(guó)辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心的James M. Wells教授，他為iPSC培養(yǎng)消化系統(tǒng)相關(guān)類器官建立完整的技術(shù)流程。

在2017年他首創(chuàng)從PSC培養(yǎng)出了消化道的類器官²。讓建立體外人類器官模型更加方便，因?yàn)橐话銓?shí)驗(yàn)室是很難獲得人的手術(shù)樣本，同時(shí)也解決了手術(shù)獲取干細(xì)胞的異質(zhì)性問(wèn)題；此外，還可以通過(guò)精確的分化調(diào)控產(chǎn)生出不同的細(xì)胞，如可以在培養(yǎng)胃底類器官時(shí)候，加BMP4處理48小時(shí)可以長(zhǎng)出胃壁細(xì)胞³；最后，還因?yàn)閕PSC保留了宿主的全部基因序列（含突變）），所以可以模擬出各個(gè)組織因?yàn)檫z傳因素可能出現(xiàn)病變。但是這樣培養(yǎng)出來(lái)的類器官也有其缺陷，因?yàn)楫吘惯�是在培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，所以無(wú)法形成體內(nèi)的環(huán)境，如神經(jīng)系統(tǒng)的控制、循環(huán)系統(tǒng)對(duì)養(yǎng)分的更新，所以這些消化道的類器官不傳代的情況下能培養(yǎng)時(shí)間一般在2周，最長(zhǎng)不過(guò)4周，而傳代就意味著類器官會(huì)被打散，因而造成其能生長(zhǎng)的尺寸有限。而James M. Wells教授為此做出了兩個(gè)解決方案。其一是使用器官芯片技術(shù)，在這種微流控芯片中進(jìn)行培養(yǎng)，這樣可以通過(guò)芯片的腔室和外置蠕動(dòng)泵來(lái)模擬出體內(nèi)的循環(huán)，從而延長(zhǎng)單代次生長(zhǎng)時(shí)間，進(jìn)而更大，而且借助液流系統(tǒng)可以方便地控制加入藥物和各位微生物或病毒的濃度和時(shí)間，便于完成藥敏、藥代和感染實(shí)驗(yàn)⁴。其二是將培養(yǎng)過(guò)的類器官植入在免疫缺陷小鼠的體內(nèi)，讓其可以融合到小鼠的器官上，讓類器官可與宿主的神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)融合，不但可以讓其長(zhǎng)得較之在培養(yǎng)皿中更大，可以達(dá)到近千倍，而在最新文章中報(bào)道，這種植入的類器官在宿主體內(nèi)開始發(fā)育出布倫納氏腺這樣有分泌功能的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，從而這種升級(jí)版的類器官為讓其往器官移植方面的應(yīng)用建立了基礎(chǔ)⁵。

到這里，是不是大家對(duì)James M. Well教授的這套技術(shù)路線非常感興趣呢？但PSC實(shí)驗(yàn)流程很長(zhǎng)，對(duì)分化節(jié)點(diǎn)的把握至關(guān)重要，因?yàn)榧?xì)胞的狀態(tài)瞬息萬(wàn)變，如果涉及熒光染色和拍照可能會(huì)耽誤這些重要節(jié)點(diǎn)，從明場(chǎng)觀察到的活細(xì)胞的狀態(tài)下就進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)判斷非常重要，所以后續(xù)部分我們先就以胃類器官為例，將培養(yǎng)過(guò)程中涉及明場(chǎng)形態(tài)觀察的要點(diǎn)進(jìn)行介紹，具體操作步驟可以點(diǎn)擊此鏈接查看原文。

下圖中的明場(chǎng)圖像皆來(lái)自Leica-Microsystems的S APO體視鏡，其擁有復(fù)消色差（APO）鏡頭，可以實(shí)現(xiàn) 8:1 變倍比以及高達(dá) 80x 的強(qiáng)大放大能力，此類鏡頭適用于可見(jiàn)光譜及更大范圍內(nèi)最高規(guī)格的應(yīng)用，可以讓您方便觀察和拍攝干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程和分化結(jié)果。

 
 
hPSC-胃類器官（GOs）培養(yǎng)過(guò)程中明場(chǎng)圖像解析³：
整個(gè)技術(shù)流程如圖1所示，圖1a中介紹了整個(gè)流程需要34天，可以從hPSC分化培養(yǎng)成胃竇類器官（hAGOs）和人胃底類器官（hFGOs）。而這2種類器官在前6天（即：Day0-5）處理方式一樣，都是分化成后段前腸球體（posterior foregut spheroids），然后包埋到基質(zhì)膠中，進(jìn)行后續(xù)的處理。而前6天的步驟中，第一階段前3天需要加入Activin A和BMP4，讓hPSC分化成單層的定形的內(nèi)胚層（DE），其的標(biāo)記物是SOX17和FOXA2。而第二階段的3天需要添加Chiron、FGF4、Noggin和RA（第5天加入）形成3D懸浮的前腸球體，其的標(biāo)記物是HNF1β和SOX2。

然后將懸浮的前腸球體包埋進(jìn)基質(zhì)膠中，如果要培養(yǎng)出hAGOs需要添加EGF、Noggin和RA先處理3天，接下來(lái)用添加EGF處理3周。如果是培養(yǎng)hFGOs，則是用EGF、CHIR、Noggin和 RA處理3天。在培養(yǎng)體系中，Noggin作為BMP信號(hào)通路的抑制劑，可以啟動(dòng)前腸球體的發(fā)育；RA讓前腸發(fā)育成后部前腸，后者的標(biāo)記物是HNF1B和GATA4。在處理的3天中，經(jīng)典wnt信號(hào)通路的激活可以讓GOs形成胃底上皮，CHIR這個(gè)小分子可以起到該作用。在Day 9，胃底球體在含有CHIR和EGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在Day 20加入FGF10直到流程結(jié)束。在Day 30的時(shí)候需要降低EGF的濃度，這樣可以增加hAGOs和hFGOs中內(nèi)分泌細(xì)胞的數(shù)量。在Day 30 對(duì)hFGOs 進(jìn)行48小時(shí)的BMP4和PD032591處理可以刺激其產(chǎn)生胃壁細(xì)胞。

 
圖1 培育和分化流程。
 
 
圖2 | 第0-3天，觀察目標(biāo)hPSC細(xì)胞的適當(dāng)匯合度，以確保hPSC能分化為DE和穩(wěn)定生成后部前腸球狀體。 a. 細(xì)胞按不同比例進(jìn)行單細(xì)胞傳代后1天，hPSC的第0天圖像，三組圖片分別展示了低、目標(biāo)和過(guò)高的匯合度。a組上部分別是傳代后的hPSC在低倍放大的情況想下低的匯合度（左）、目標(biāo)匯合度（中）和過(guò)于密集的匯合度（右）。而a組下部依次是低的匯合度（左）、目標(biāo)匯合度（中）和過(guò)于密集的匯合度（右）。b. 第3天，在3天Activin A處理結(jié)束時(shí)，達(dá)到目標(biāo)匯度的DE細(xì)胞單層的低倍（頂部）和高倍（中間和底部）圖像。c. 第6天預(yù)期的球狀體生成低倍圖像，生成結(jié)果為差（左）、旺盛（中間）和中等（右）。a,b. 在圖像采集前更換培養(yǎng)基以去除細(xì)胞碎片。比例尺，1mm（a,b（頂部和中心），c）；250 μm（b，底部）�！咀ⅲ阂�?yàn)橐�保證各個(gè)圖像的亮度匹配，所以對(duì)a中頂部圖像的亮度進(jìn)行了調(diào)整�！�
 
 
圖3 - 第4-20天，后前腸球狀體生成、hAGOs和hFGOs在基質(zhì)膠中生長(zhǎng)相關(guān)的形態(tài)學(xué)變化。a. (上排)，第4天的低倍（左）和高倍（右）放大圖像，整個(gè)孔中出現(xiàn)了可以形成球狀體的單層細(xì)胞，表現(xiàn)為3D出芽形態(tài)。（中排）第5天，可以形成球狀體的單層細(xì)胞的低倍（左）和高倍（右）放大圖像，因?yàn)?D形態(tài)形成了許多貼壁的出芽球狀體和一些自由漂浮的球狀體。（下排）第6天的低倍（左）和高倍（右），可以形成球狀體的單層細(xì)胞（其中有大量可以進(jìn)行收集的自由漂浮球狀體），單層細(xì)胞基本上沒(méi)有3D出芽形態(tài)。b. 第6天，自由漂浮在培養(yǎng)基中的單個(gè)球狀體的高倍放大圖像。來(lái)自同一代的球狀體在形狀和大小上各不相同，但都被包被在基質(zhì)膠中以備將來(lái)生長(zhǎng)。c. 在基質(zhì)膠中的胃竇和胃底球狀體在第9天（上排）、第13天（第二排）和第20天（第三排）長(zhǎng)成hGO的低倍倍放大圖像。插圖顯示了基質(zhì)膠中單個(gè)球狀體的放大圖像。（下排）第20天高倍放大的hAGO和hFGO圖像，有大量非計(jì)劃的神經(jīng)生長(zhǎng)（綠色箭頭）。在選擇hGO作進(jìn)一步培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)避免選擇這種hGO，以減少密度。比例尺，1 mm（a,c），250μm（b）。白色方框內(nèi)的插圖是5倍數(shù)字放大的圖像；插圖的寬度為~833μm（c）�！咀ⅲ簩�(duì)c的上排圖像亮度進(jìn)行了調(diào)整，以使其與其他圖像的亮度匹配。】
 
 
圖4 – 降低了EGF濃度后，在基質(zhì)膠中生長(zhǎng)的hGO中胃竇和胃壁細(xì)胞的狀態(tài)。 白色箭頭指示hAGO發(fā)育出的內(nèi)部腺體。黃色箭頭表示在hFGO中發(fā)育出外部腺體的出芽。綠色箭頭指示了一個(gè)在低EGF濃度下發(fā)育出來(lái)的神經(jīng)叢。a,b,在Day 24（上排）、27（中排）和34（下排），在基質(zhì)膠中生長(zhǎng)的hAGO和hFGO的低倍（左）和高倍（右）放大圖像。a（下排），發(fā)育后的hAGO顯示有清晰的管腔和旺盛的內(nèi)部腺體。b（下排），發(fā)育后的hFGOs顯示有旺盛的外部腺體出芽，腔內(nèi)可能含有或不含有很多細(xì)胞碎片。比例尺，1 mm�！咀ⅲ簩�(duì)下排圖像的亮度進(jìn)行了調(diào)整，以使其與其他圖像的亮度匹配�！�
 
下一篇將會(huì)為大家?guī)��?lái)類器官移植到免疫缺陷小鼠的操作流程解析。
 
 
1. Kazutoshi Takahashi, Shinya Yamanaka. (2006). Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell 126, 663–676.
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