化學(xué)發(fā)光方法簡(jiǎn)介： IVD行業(yè)技術(shù)擔(dān)當(dāng)（下）

上一期，我們大致介紹了化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理和優(yōu)缺點(diǎn)，下面我們就來(lái)詳細(xì)說(shuō)說(shuō)三種分類的不同之處。
 

01  直接化學(xué)發(fā)光免疫分析

直接化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物——acridinium ester (A E) , 是有效的發(fā)光標(biāo)記物。其通過(guò)起動(dòng)發(fā)光試劑（NaOH₂、H₂O₂）作用而發(fā)光，強(qiáng)烈的直接發(fā)光在一秒鐘內(nèi)完成， 為快速的閃爍發(fā)光。
 
吖啶酯作為標(biāo)記物用于免疫分析，其化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速、無(wú)須催化劑；檢測(cè)小分子抗原采用競(jìng)爭(zhēng)法，大分子抗原則采用夾心法，非特異性結(jié)合少，本底低；與大分子的結(jié)合不會(huì)減小所產(chǎn)生的光量， 從而增加靈敏度。
 
CLIA開(kāi)發(fā)主要包括以下幾個(gè)步驟：
 

磁珠包被抗體

( 以下步驟需依據(jù)項(xiàng)目不同進(jìn)行工藝優(yōu)化 )

BeaverBeads®Streptavidin鏈酶親和素磁珠

利用鏈酶親和素和生物素的高特異性結(jié)合能力，BeaverBeadsRStreptavidin可與biotin標(biāo)記的高純度抗體/多肽分子或核酸分子特異性結(jié)合，并具有級(jí)聯(lián)放大的作用，是一種通用的具有標(biāo)記和捕獲性能的固相介質(zhì)原料。

 

根據(jù)粒徑的不同，產(chǎn)品可用免疫檢測(cè)、探針捕獲、細(xì)胞分選等領(lǐng)域，尤其適用于化學(xué)發(fā)光免疫診斷。

 
BeaverBeads®NHS生物配體快速偶聯(lián)磁珠

表面為NHS基團(tuán)修飾的磁珠，能夠與帶有伯胺基團(tuán)的蛋白和其他分子形成穩(wěn)定的肽鍵，用于親和純化或者分析檢測(cè)抗體、抗原和其他生物分子。

 

與傳統(tǒng)的羧基、氨基磁珠相比，無(wú)需事先采用EDC/NHS或戊二醛進(jìn)行活化，只需簡(jiǎn)單講含伯氨基的生物配體溶解于偶聯(lián)緩沖液中，室溫下將蛋白溶液與NHS磁珠混合即可將生物配體共價(jià)偶聯(lián)到磁珠上，偶聯(lián)效率可達(dá)90%以上；偶聯(lián)體系pH為5-9.

 
BeaverBeads®Polymer聚合物磁珠

具有快速磁響應(yīng)性超順磁性、良好的分散性、粒徑均一、極低的非特異性吸附和豐富的結(jié)合位點(diǎn)等特點(diǎn)。在特定試劑（如EDC/NHS）作用下，將多種生物配體（蛋白、多肽、寡聚核苷酸、藥物分子等）共價(jià)偶聯(lián)到磁珠表面。常用于檢測(cè)、捕獲等試驗(yàn)。

 
Beaver Magnetic Seprator stand磁性分離器

為快速分離磁珠的手工操作或高通量的自動(dòng)化操作而設(shè)計(jì)的一系列不同規(guī)格的專用磁性分離工具，適用于抗體純化、免疫沉淀、免疫共沉淀、細(xì)胞分選、核酸分離等相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

 

吖啶酯標(biāo)記抗體

①將0.5mg抗體用標(biāo)記緩沖液（0.1M pH7.4 PB）預(yù)處理；
②將0.1mg的吖啶鹽加入到預(yù)處理的抗體中，放置于恒溫?fù)u床中避光孵育過(guò)夜；
③標(biāo)記完成后，將結(jié)合物純化，加入BSA等蛋白保護(hù)劑，4℃避光保存。
 
吖啶酯是一類可用作化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的化學(xué)物質(zhì)，吖啶酯或吖啶磺酰胺類化合物在有H₂O₂的稀堿性溶液中即能發(fā)光，不需要催化劑，發(fā)光系統(tǒng)簡(jiǎn)單。
 
同時(shí)這類化合物的發(fā)光為閃光型，加入發(fā)光啟動(dòng)試劑后0.4s左右發(fā)射光強(qiáng)度即達(dá)到最大，半衰期為0.9s左右，非常省時(shí)。
 
基于上述特點(diǎn)，為增強(qiáng)吖啶酯或吖啶磺酰胺類化合物的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，有些在發(fā)光啟動(dòng)試劑中加入triton x-100、tween-20等表面活性劑。
 

上機(jī)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

①將磁珠包被物和吖啶酯標(biāo)記物分別稀釋至工作濃度，配成試劑；
②設(shè)置全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀，裝載試劑，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)控品樣本分別上機(jī)，選擇對(duì)應(yīng)的項(xiàng)目，直接進(jìn)行檢測(cè)；
③檢測(cè)剩余時(shí)間及檢測(cè)結(jié)果會(huì)顯示在屏幕上，可通過(guò)“查詢”查看歷史數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊“導(dǎo)出”可將數(shù)據(jù)保存為Excel格式文件。
 

02   間接化學(xué)發(fā)光免疫分析

間接化學(xué)發(fā)光免疫分析又稱化學(xué)發(fā)光酶免疫分析，以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)，免疫復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號(hào)試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)試。常用的標(biāo)記為HRP和AP，它們的底物分別為魯米諾和AMPPD。
 
1 具體工藝流程：
 
 

包被抗體的磁性微粒

 

加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品

 

清洗

 

加入酶標(biāo)抗體/生物素化抗體

 

洗板

 

加入鏈酶親和素HRP

 

清洗

 

加入底物液

 

測(cè)試發(fā)光信號(hào)（如是板式發(fā)光可參考Elisa操作方式）

 

03   電化學(xué)發(fā)光免疫分析

電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是電化學(xué)發(fā)光和免疫測(cè)定相結(jié)合的產(chǎn)物，是目前最先進(jìn)的標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)之一。
 
在電極表面有電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕 [Ru(bpy) 3 ] 2+ 標(biāo)記 Ab，通過(guò) Ag-Ab 反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對(duì)待測(cè)的 Ag或 Ab 進(jìn)行定量 / 定性。
 
ELIA 具有高度敏感，可達(dá) Pg/ml 或 pmol ；特異性強(qiáng)，可重復(fù)性好，CV<5%；測(cè)定范圍寬；試劑穩(wěn)定，無(wú)毒害，無(wú)污染，有效期長(zhǎng)。操作簡(jiǎn)單，易于自動(dòng)化。