配合Genizer脂質(zhì)體擠出器對(duì)聚乙烯亞胺/DNA復(fù)合物進(jìn)行“包衣”

目前，基于“向自然學(xué)習(xí)”理念的“仿生偽裝”策略正日益流行。如紅細(xì)胞偽裝、細(xì)菌囊泡、病毒樣顆粒、靶向源細(xì)胞和細(xì)胞膜包裹納米微粒等都被認(rèn)為是下一代基因載體的潛在策略。

在各種陽(yáng)離子聚合物基因載體中，聚乙烯亞胺PEI作為基準(zhǔn)聚合物載體被廣泛使用。聚乙烯亞胺能將DNA濃縮成納米大小的復(fù)合物(多聚體)，便于細(xì)胞內(nèi)吞。聚乙烯亞胺一旦進(jìn)入細(xì)胞，其質(zhì)子海綿效應(yīng)、緩沖能力和溶膜能力可促進(jìn)多聚體的核內(nèi)體逃逸。因此，基于聚乙烯亞胺的基因載體設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)對(duì)促進(jìn)基因治療的發(fā)展具有重要意義，但其較高的正電荷量和缺乏基因轉(zhuǎn)移靶向性所帶來(lái)的固有細(xì)胞毒性等缺陷限制了其臨床應(yīng)用。因此，雖然聚乙烯亞胺作為非病毒基因載體的杰出代表被廣泛關(guān)注和研究，但聚乙烯亞胺/DNA復(fù)合物在體內(nèi)環(huán)境中的細(xì)胞毒性較高是阻礙聚乙烯亞胺被應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)的主要瓶頸之一。當(dāng)前正在大力發(fā)展的先進(jìn)的非病毒基因載體中，聚乙烯亞胺仍然被奉為評(píng)價(jià)非病毒基因載體效率的黃金標(biāo)準(zhǔn)。

受新型細(xì)胞膜包衣策略的啟發(fā)，本研究通過293T細(xì)胞膜對(duì)聚乙烯亞胺/DNA復(fù)合物進(jìn)行“包衣”，制備復(fù)合物膠囊(293T細(xì)胞膜聚乙烯亞胺/DNA復(fù)合體293T-CPDc)作為DNA遞送平臺(tái)，以降低聚乙烯亞胺/DNA復(fù)合物的陽(yáng)離子細(xì)胞毒性。具體如方案圖1所示，采用擠壓法制備293T-CPDc納米顆粒，通過DLS、Zeta電位、TEM、SDS-PAGE等多種方法對(duì)其進(jìn)行表征。然后，可以通過對(duì)293T-CPDc的DNA攜帶能力、保護(hù)能力、釋放能力、細(xì)胞攝取效率、轉(zhuǎn)染效率和安全性的研究，系統(tǒng)地評(píng)價(jià)293T-CPDc復(fù)合物作為基因遞送系統(tǒng)發(fā)展的潛力。

 

圖1細(xì)胞膜“包衣”復(fù)合物基因遞送系統(tǒng)的主要研究思路。
（a）復(fù)合物的制備策略。（b）復(fù)合物的細(xì)胞攝入及包內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程

 

主要試劑與設(shè)備

聚乙烯亞胺（M.W.30000）PEI30K

聚乙烯亞胺（M.W.70000）PEI70K

脂質(zhì)體擠出器 美國(guó)Genizer

激光粒度儀 英國(guó)馬爾文

透射電子顯微鏡 德國(guó)徠卡公司

 

主要實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

1. 細(xì)胞培養(yǎng)

293T細(xì)胞使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2和90%相對(duì)濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每隔1~2天，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%～90%，傳代一次。

 

2. 293T細(xì)胞膜（293T-CM）的提取

293T細(xì)胞在含10%胎牛血清、1%雙抗的完全培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2和90%相對(duì)濕度培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%，不使用胰蛋白酶進(jìn)行消化，直接將其吹下，4℃條件下3000rpm離心3min后吸除培養(yǎng)液，用4℃預(yù)凍的等滲1×PBS緩沖液將細(xì)胞重懸，4℃條件下3000rpm離心3分鐘后移除上清液。重復(fù)2-3次洗滌細(xì)胞。洗滌完成后，加入4℃預(yù)凍的0.1×PBS低滲緩沖液，置于4℃環(huán)境下放置30min，在低滲溶液中使細(xì)胞漲破。然后放入液氮中冷凍8秒，拿出后在室溫恢復(fù)液態(tài)，再放入液氮冷凍，這種快凍慢融會(huì)破壞細(xì)胞膜完整性，使其成為小的膜囊。如此反復(fù)凍融5次，待其恢復(fù)至液態(tài)后，在4℃條件下以14800rpm離心10min，棄掉上清，小的細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)含物被丟棄。收集沉淀，用無(wú)菌水將其重懸，并進(jìn)行冷凍干燥。將所得固體293T-CM碎片重懸于無(wú)菌水中配制濃度為1mg/mL的293T-CM懸液待用，并于-20℃保存。

 

3. 293T-CPDc復(fù)合物的制備

（1）聚乙烯亞胺/DNA復(fù)合物最佳質(zhì)量比的確定

以瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)確定了不同分子量聚乙烯亞胺與DNA完全結(jié)合的質(zhì)量比以及聚乙烯亞胺/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染的最佳質(zhì)量比。如圖2 (a)、（b）所示，隨著質(zhì)量比的增加，聚乙烯亞胺30k與聚乙烯亞胺70k均表現(xiàn)出逐漸結(jié)合的趨勢(shì)，在質(zhì)量比為1.5/1左右時(shí)，聚乙烯亞胺30k與DNA完全結(jié)合；質(zhì)量比為0.75/1時(shí)，聚乙烯亞胺70k與DNA完全結(jié)合，DNA完全滯留于孔中。因此我們?cè)谶@兩個(gè)質(zhì)量比附近選取梯度進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，確定聚乙烯亞胺/DNA復(fù)合物的最佳轉(zhuǎn)染質(zhì)量比。由圖2 （c）可以看出，在質(zhì)量比為1.5/1~4/1的范圍內(nèi)，聚乙烯亞胺30k/DNA復(fù)合轉(zhuǎn)染效率呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，且在質(zhì)量比為2.5/1時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，約為33.5%，之后隨著質(zhì)量比的增加，轉(zhuǎn)染效率下降。同樣地，由圖2（d）可得，在質(zhì)量比為0.5/1~2.5/1的梯度范圍內(nèi)，聚乙烯亞胺70k/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率先增后減，在質(zhì)量比為0.75/1時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，約為68.4%。

綜上，我們通過瓊脂糖凝膠電泳確定聚乙烯亞胺與DNA完全結(jié)合的質(zhì)量比之后，在其一定的梯度范圍內(nèi)，通過聚乙烯亞胺/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率篩選最佳質(zhì)量比。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們確定2.5/1及0.75/1分別為聚乙烯亞胺30k/DNA復(fù)合物和聚乙烯亞胺70k/DNA復(fù)合物在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)量比。

 

 

圖2不同質(zhì)量比下聚乙烯亞胺30k(a)、聚乙烯亞胺70k(b)
與DNA絡(luò)合的電泳遷移阻滯實(shí)驗(yàn)以及不同質(zhì)量比

 

（2）293T-CPDc復(fù)合物的制備

如圖3所示，我們首先對(duì)293T-CM進(jìn)行提取制備，并根據(jù)前步選用的聚乙烯亞胺/DNA復(fù)合物最佳質(zhì)量比，依靠聚乙烯亞胺表面大量正電荷與DNA表面負(fù)電荷間的靜電相互作用，分別制備聚乙烯亞胺30k/DNA與聚乙烯亞胺70k/DNA復(fù)合物。隨后將293T-CM分別與兩種復(fù)合物共混孵育，并通過Genizer脂質(zhì)體擠出儀擠壓通過孔徑為200nm的聚碳酸酯多孔膜，使細(xì)胞膜對(duì)聚乙烯亞胺/DNA復(fù)合物進(jìn)行“包衣”，制備得293T-CPDc復(fù)合物。

 

圖3 CPDc復(fù)合物的制備路線圖

 

4. 293T-CPDc復(fù)合物的表征

（1）293T-CPDc復(fù)合物的粒徑和Zeta電位

使用納米粒度儀對(duì)不同復(fù)合物的粒徑及Zeta電位進(jìn)行了測(cè)定。由圖4可以看出，細(xì)胞膜碎片的粒徑大小為400nm左右，這可能是由于細(xì)胞膜碎片之間相互粘連導(dǎo)致粒徑過大；此外，由于細(xì)胞膜的主要結(jié)構(gòu)為雙層磷脂，其中親水性的磷酸基團(tuán)使得細(xì)胞膜呈現(xiàn)負(fù)電性。由于所有質(zhì)量比的293T-CPDc復(fù)合物均由Genizer脂質(zhì)體擠出儀擠壓通過200nm聚碳酸酯多孔膜，且此膜與常見用于除菌的微孔濾膜不同，其分布和大小較為均勻，孔道較直，因此使得復(fù)合物粒徑均勻分布在200nm上下，且隨著細(xì)胞膜質(zhì)量的增加，293T-CPDc復(fù)合物的粒徑分布較為均勻，未出現(xiàn)較大波動(dòng)。據(jù)圖4（b）可以看出，由于細(xì)胞膜“包衣”的擠壓作用，293T-CP70Dc復(fù)合物的粒徑較聚乙烯亞胺70k/DNA復(fù)合物進(jìn)一步減小。

 

此外，由Zeta電位可以看出，兩種不同分子量的聚乙烯亞胺在與DNA結(jié)合后，仍具有較高水平的正電荷量，這會(huì)導(dǎo)致較大的陽(yáng)離子細(xì)胞毒性，從而降低細(xì)胞攝入水平及轉(zhuǎn)染效率�？梢钥闯觯�在加入細(xì)胞膜后，兩種復(fù)合物的正電荷量隨著細(xì)胞膜質(zhì)量的增加而降低，成功的屏蔽了部分聚乙烯亞胺/DNA復(fù)合物表面的過量正電荷。隨著細(xì)胞膜質(zhì)量增加，細(xì)胞膜逐漸過量，復(fù)合物的凈電荷表現(xiàn)為負(fù)電。

 

圖4 五種不同質(zhì)量比的293T-CP30Dc（a）和293T-CP70Dc（b）復(fù)合物的粒徑及Zeta電位（mean±SD，n=3）。以293T-CM、聚乙烯亞胺30k/DNA和聚乙烯亞胺70k/DNA復(fù)合物作為對(duì)照。

 

（2）293T-CM對(duì)聚乙烯亞胺/DNA復(fù)合物的包封率

通過包封率測(cè)定，對(duì)兩種復(fù)合物包封的最佳質(zhì)量比及擠壓次數(shù)進(jìn)行篩選。由圖5（a）可以看出，隨著質(zhì)量比的增加，293T-CM對(duì)聚乙烯亞胺30k/DNA復(fù)合物的包封率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，并且在質(zhì)量比為2/2.5/1時(shí)包封率最高。在質(zhì)量比為2/0.75/1時(shí)，隨著擠壓次數(shù)的增加，包封率大小并未有過大浮動(dòng)。另由圖5（b）可以看出，隨著質(zhì)量比增加，293T-CM對(duì)聚乙烯亞胺70k/DNA復(fù)合物包封率同樣呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，這或許是由于加入過量的細(xì)胞膜反而抑制了其對(duì)聚乙烯亞胺/DNA復(fù)合物的包封。在質(zhì)量比為2/0.75/1,293T-CM對(duì)聚乙烯亞胺70k/DNA復(fù)合物的包封率最高，且在此質(zhì)量比下，隨著擠壓次數(shù)增加，包封率同樣先增后減，在擠壓15次時(shí)達(dá)到最高包封率約82%。因此，在之后的實(shí)驗(yàn)中，我們均對(duì)復(fù)合物進(jìn)行15次擠壓處理，獲得較高的包封率，以此進(jìn)一步提高細(xì)胞攝入及轉(zhuǎn)染水平.

 

圖5 不同質(zhì)量比及擠壓次數(shù)下293T-CM對(duì)聚乙烯亞胺30k/DNA（a）和聚乙烯亞胺70k/DNA（b）復(fù)合物的包封率

 

表1 不同質(zhì)量比及擠壓次數(shù)下293T-CM對(duì)聚乙烯亞胺30k/DNA的包封率

表2 不同質(zhì)量比及擠壓次數(shù)下293T-CM對(duì)聚乙烯亞胺70k/DNA的包封率