與共濟(jì)失調(diào)相關(guān)的Dnmt1基因及其基因編輯小鼠的介紹和研究

Dnmt1基因編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶I，可將甲基轉(zhuǎn)移到基因組DNA的胞嘧啶核苷酸上，該基因的異常與耳聾、小腦共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)。今天和大家見面的是Dnmt1基因編輯小鼠。

⭐ Dnmt1基因簡(jiǎn)介
該基因編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶I，該酶是DNA胞嘧啶甲基化的維持酶，可將甲基轉(zhuǎn)移到基因組DNA的胞嘧啶核苷酸上，在胚胎發(fā)生期間和出生后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）高表達(dá)。該基因的變異與小腦共濟(jì)失調(diào)、耳聾和發(fā)作性睡病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)。其相關(guān)途徑包括激活的PKN1刺激AR（雄激素受體）調(diào)節(jié)基因KLK2和KLK3的轉(zhuǎn)錄以及胞嘧啶甲基化。
 

圖1. Dnmt1的基因相關(guān)信息（https://rddc.tsinghua-gd.org/）

圖2. Dnmt1蛋白結(jié)構(gòu)（https://alphafold.ebi.ac.uk/）

⭐ Dnmt1相關(guān)疾病介紹
與DNMT1相關(guān)的疾病有小腦共濟(jì)失調(diào)、耳聾和發(fā)作性睡病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

小腦共濟(jì)失調(diào)是因腦組織變形而引起的隨意運(yùn)動(dòng)失調(diào)的病癥，小腦共濟(jì)失調(diào)的主要臨床癥狀為四肢共濟(jì)失調(diào)、吞咽困難、眼球突出、肌張力障礙、痙攣等。該癥可分為繼發(fā)性小腦共濟(jì)失調(diào)和遺傳性小腦共濟(jì)失調(diào)。繼發(fā)性小腦共濟(jì)失調(diào)的致病因素有感染、乙醇中毒、維生素缺乏、代謝疾病、心血管疾病及腫瘤等。遺傳性小腦共濟(jì)失調(diào)可分為常染色體顯性遺傳性、常染色體隱性遺傳性以及X連鎖性小腦共濟(jì)失調(diào)。該病的治療藥物有激素類藥物（腎上腺皮質(zhì)激素）、免疫球蛋白與丁螺環(huán)酮等[1,2]。

⭐ Dnmt1基因編輯小鼠
✔ CNS前體細(xì)胞特異性敲除小鼠：
Fan G等人在Dnmt1基因4和5號(hào)外顯子兩側(cè)插入loxp位點(diǎn)，再通過與Nestin-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，以產(chǎn)生敲除4和5號(hào)外顯子序列的CNS前體細(xì)胞特異性敲除小鼠。研究人員對(duì)剖腹產(chǎn)的E18.5和E19.5小鼠進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照小鼠（Dnmt12lox/2lox）相比，特異性敲除小鼠（Dnmt12lox/2lox；Nestin-Cre）在產(chǎn)后1h內(nèi)死亡。電生理學(xué)結(jié)果表明，正常小鼠產(chǎn)后5min舌下神經(jīng)活動(dòng)表現(xiàn)出有節(jié)奏的類似喘息的模式圖（12/min），隨著呼吸頻率和心率的增加，其舌下神經(jīng)活動(dòng)也加快，并在10-20分鐘內(nèi)保持平穩(wěn)，相比之下Dnmt12lox/2lox；Nestin-Cre小鼠僅產(chǎn)生零星的喘息活動(dòng)，并在分娩后20-30分鐘持續(xù)心跳異常，不久后死亡。病理組織學(xué)結(jié)果表明，Dnmt12lox/2lox；Nestin-Cre小鼠腦干舌下神經(jīng)元形態(tài)正常（圖3）［3］。

✔ PV細(xì)胞敲除小鼠：
Hahn A等人將Dnmt1loxP2與Pvalb-Cre/tdTomato小鼠交配，以產(chǎn)生PV（小白蛋白）細(xì)胞敲除小鼠。研究發(fā)現(xiàn)，WT（Pvalb-Cre/tdTomato）小鼠運(yùn)動(dòng)和視覺皮層區(qū)域的tdTomato細(xì)胞顯著減少，表層和深層皮質(zhì)層均受到中間神經(jīng)元減少的影響，小鼠的細(xì)胞密度在12月齡時(shí)開始呈下降趨勢(shì)，這表明中間神經(jīng)元是12月齡開始退化的。與WT相比，16月齡的Dnmt1 KO（Pvalb-Cre/tdTomato/Dnmt1loxP2）小鼠的運(yùn)動(dòng)和視覺皮層區(qū)域tdTomato陽性中間神經(jīng)元密度顯著更高。以上結(jié)果表明，Dnmt1缺失顯著提高了表達(dá)PV的皮質(zhì)中間神經(jīng)元的長(zhǎng)期存活率，Dnmt1功能直接或間接損害老年小鼠皮質(zhì)PV中間神經(jīng)元存活率（圖4）［4］。

圖3. 第１２顱舌下神經(jīng)活動(dòng)。

圖注：A：舌下神經(jīng)呼吸放電的電生理記錄。每條跡線圖均是用皮下電極獲得的心電圖記錄（第二條跡線圖為膈肌電圖）。B：腦干舌下神經(jīng)元組織學(xué)切片，E18.5石蠟切片。比例尺：37.5 μm。

圖4. Dnmt1 敲除增強(qiáng)了皮質(zhì)中間神經(jīng)元的長(zhǎng)期存活率。

圖注：(A,B)：矢狀切片(Bregma 1.44)顯微照片顯示6、12和16個(gè)月大的Pvalb-Cre/tdTomato (WT, A) 和 Pvalb-Cre/tdTomato/Dnmt1loxP2 ( KO，B)小鼠顯示tdTomato（紅色）和DAPI陽性細(xì)胞（藍(lán)色）。每個(gè)區(qū)域的細(xì)胞密度在 (C) 中進(jìn)行了量化。（D）：6個(gè)月和16個(gè)月大的Dnmt1 WT和KO小鼠在運(yùn)動(dòng)，體感和視覺皮層中的細(xì)胞密度的特異性分析。分析切片的數(shù)量如下：6個(gè)月大的WT：運(yùn)動(dòng)皮層n=16，軀體感覺皮層n=15，視覺皮層n=13；6個(gè)月大的KO：運(yùn)動(dòng)皮層 n=19，體感和視覺皮層 n=16；12個(gè)月大的WT和KO：每個(gè)皮層區(qū)域n=9個(gè)切片；16個(gè)月大的WT：運(yùn)動(dòng)和視覺皮層n=14，體感皮層n=12；16個(gè)月大的 KO每個(gè)皮質(zhì)區(qū)域n=9（來自每個(gè)基因型和年齡的N=3個(gè)不同的大腦）。比例尺：100 μm。

⭐ 總結(jié)
小鼠Dnmt1功能喪失所導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)異常具有潛在的臨床意義，對(duì)該基因的深入研究有助于探討神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)亦可用于此類疾病治療新方法的研究。

⭐ 參考文獻(xiàn)：

1. Miranda CO, Nobre RJ, Paiva VH, Duarte JV, Castelhano J, Petrella LI, Sereno J, Santana M, Afonso S, Januário C, Castelo-Branco M, de Almeida LP. Cerebellar morphometric and spectroscopic biomarkers for Machado-Joseph Disease. Acta Neuropathol Commun. 2022 Mar 19;10(1):37. doi: 10.1186/s40478-022-01329-4. PMID: 35305685; PMCID: PMC8933766.

2. Rajan DS, Kour S, Fortuna TR, Cousin MA, Barnett SS, Niu Z, Babovic-Vuksanovic D, Klee EW, Kirmse B, Innes M, Rydning SL, Selmer KK, Vigeland MD, Erichsen AK, Nemeth AH, Millan F, DeVile C, Fawcett K, Legendre A, Sims D, Schnekenberg RP, Burglen L, Mercier S, Bakhtiari S, Martinez-Salas E, Wigby K, Lenberg J, Friedman JR, Kruer MC, Pandey UB. Autosomal Recessive Cerebellar Atrophy and Spastic Ataxia in Patients With Pathogenic Biallelic Variants in GEMIN5. Front Cell Dev Biol. 2022 Feb 28;10:783762. doi: 10.3389/fcell.2022.783762. PMID: 35295849; PMCID: PMC8918504.

3. Fan G, Beard C, Chen RZ, Csankovszki G, Sun Y, Siniaia M, Biniszkiewicz D, Bates B, Lee PP, Kuhn R, Trumpp A, Poon C, Wilson CB, Jaenisch R. DNA hypomethylation perturbs the function and survival of CNS neurons in postnatal animals. J Neurosci. 2001 Feb 1;21(3):788-97. doi: 10.1523/JNEUROSCI.21-03-00788.2001. PMID: 11157065; PMCID: PMC6762314.

4. Hahn A, Pensold D, Bayer C, Tittelmeier J, González-Bermúdez L, Marx-Blümel L, Linde J, Groß J, Salinas-Riester G, Lingner T, von Maltzahn J, Spehr M, Pieler T, Urbach A, Zimmer-Bensch G. DNA Methyltransferase 1 (DNMT1) Function Is Implicated in the Age-Related Loss of Cortical Interneurons. Front Cell Dev Biol. 2020 Jul 22;8:639. doi: 10.3389/fcell.2020.00639. PMID: 32793592; PMCID: PMC7387673.