Zeocin 博來霉素 Sh ble基因篩選抗生素

Zeocin是腐草霉素D1（Phleomycin D1）的商業(yè)名稱，其中文名稱博來霉素是一種銅離子螯合的糖肽抗生素（來源于鏈霉菌Streptomyces verticillus的突變株），銅離子的存在使其呈藍(lán)色，此銅螯合的形式為無活性。當(dāng)抗生素進(jìn)入細(xì)胞后，二價(jià)銅離子（Cu2+）被還原為一價(jià)銅離子（Cu+），并被細(xì)胞內(nèi)的巰基化合物去除。銅離子被去除后，Zeocin被活化，嵌入DNA使其斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。博來霉素是作用譜廣泛，對(duì)細(xì)菌、真核微生物、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞具很強(qiáng)的毒性。博來霉素常用作一種非常有效的工具抗生素，用來篩選攜帶Sh ble抗性基因并能穩(wěn)定表達(dá)分子量為13.665 kDa的一種博來霉素抗性蛋白的細(xì)胞株。博來霉素是的用量為 50-2000 ug/ml（通常 300 ug/ml），具體取決于細(xì)胞類型。

warbio公司提供無菌溶液形式的Zeocin，濃度是100mg/ml，使用起來更加方便，只需直接加入培養(yǎng)基到所需工作濃度即可。

產(chǎn)品性質(zhì)

分子式（Formula）：C55H85O21N20S2Cu - HCl

Cas: 11006-33-0

分子量（Molecular Weight）：1535

外觀（Appearance）：藍(lán)色粉末

內(nèi)毒素：＜1 EU/mg

純度（Purity）：>90%(HLPC)

溶解性：易溶于水（>500 mg/ml）

細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試：在 Zeocin® 敏感和 Zeocin® 抗性哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中驗(yàn)證效力

微量污染物無細(xì)胞毒性：在抗 Zeocin® 細(xì)胞中證實(shí)不存在長(zhǎng)期影響

應(yīng)用參考濃度：

1）大腸桿菌篩選：25-50μg/mL（低鹽LB培養(yǎng)基，NaCl濃度不能超過5g/L）

2）酵母菌篩選：50-300μg/mL（YPD或基本培養(yǎng)基）

3）哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選：50-1000μg/mL（合適培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞系而不同）

使用步驟參考

一、細(xì)胞對(duì)Zeocin敏感性的確定（殺滅曲線建立）

重新鋪板或者將滿盤細(xì)胞重新分盤，使得細(xì)胞密度約25%，按照8個(gè)平板/組準(zhǔn)備，培養(yǎng)24h，去除舊培養(yǎng)基。

加入含不同濃度Zeocin的篩選培養(yǎng)基，Zeocin濃度可設(shè)置為0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000 μg/ml，每個(gè)濃度做3個(gè)平行；也可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)體系，設(shè)置不同的濃度梯度。

每3-4天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察存活細(xì)胞的比例。選擇在合適時(shí)間（1-2周內(nèi)）殺死大多數(shù)細(xì)胞的濃度為最加工作濃度。【注】：若是難以在顯微觀察下區(qū)分活細(xì)胞，建議使用臺(tái)盼藍(lán)染色來計(jì)算存活細(xì)胞的數(shù)量，以確定Zeocin的最適濃度。

二、篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系

轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用100mm培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

轉(zhuǎn)染后，用預(yù)熱的1X PBS洗滌一次，加入新鮮培養(yǎng)基。

轉(zhuǎn)染48-72h后，用含有最加濃度Zeocin（由滅殺曲線確定）的新鮮培養(yǎng)基篩選細(xì)胞。為了更好的鑒定和篩選細(xì)胞集落，建議將細(xì)胞按比例稀釋成一系列濃度。

【注】：若待篩選細(xì)胞對(duì)Zeocin的抗性明顯強(qiáng)于大部分細(xì)胞，按照以下方法克服此類耐性：用含Zeocin培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞分盤，置于37°C孵育2-3h，使得細(xì)胞貼壁。然后將細(xì)胞置于4°C，2h。記得使用Hepes作為培養(yǎng)基的緩沖體系。重新將細(xì)胞置于37°C孵育。4°C孵育細(xì)胞的目的是短時(shí)間內(nèi)終止細(xì)胞分化，使得Zeocin能發(fā)揮作用，殺死細(xì)胞。

每3-4天更換新鮮的選擇培養(yǎng)基，直到出現(xiàn)細(xì)胞集落。

挑選并轉(zhuǎn)移克隆到96或48孔板中。在進(jìn)行更大孔徑培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上擴(kuò)大培養(yǎng)之前，確保培養(yǎng)細(xì)胞密度近100%。

三、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的維持培養(yǎng)

可采取以下方式維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞：

1）使用含相同劑量Zeocin的篩選培養(yǎng)基來維持培養(yǎng)；

2）降低Zeocin劑量為原來的一半進(jìn)行維持培養(yǎng)；

3）使用正好能預(yù)防敏感細(xì)胞生長(zhǎng)但不足以致死的Zeocin劑量來維持培養(yǎng)【根據(jù)殺滅曲線來判斷】。