與ALS肌萎縮側(cè)索硬化癥相關(guān)的致病基因及人源化小鼠模型介紹

⭐ 致病基因
當(dāng)前ALS致病因素公認最相關(guān)的是年齡和遺傳。年齡因素同時也是很多神經(jīng)退行性疾病的最大致病風(fēng)險；遺傳性ALS雖然占病患比例僅為5%，但仍有20多個基因被列入ALS的元兇名單。早在1993年，超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）被發(fā)現(xiàn)與ALS密切相關(guān)，大概20%的遺傳性ALS與之相關(guān)。正常的SOD1會將細胞產(chǎn)生的具有活性的過氧化物轉(zhuǎn)化成過氧化氫和氧氣，而突變的SOD1不能完成這個任務(wù)，從而造成神經(jīng)元氧化損傷，出現(xiàn)神經(jīng)肌肉功能損傷。

罕見病基因：SOD1

突變的SOD1蛋白本身會在細胞內(nèi)聚集形成內(nèi)涵體，但在ALS中出現(xiàn)聚集最多的并不是SOD1，而“另有其人”。由于SOD1發(fā)現(xiàn)得早，所以相關(guān)研究最為豐富，隨著對ALS的深入研究，SOD1其他致病機理逐漸被挖掘，包括軸突運輸、脊髓毛細管出血、誘發(fā)炎癥、破壞髓翹等方面。

2001年，發(fā)現(xiàn)與早發(fā)型ALS相關(guān)的ALS2，該基因編碼的蛋白負責(zé)核內(nèi)體轉(zhuǎn)運；

2002年發(fā)現(xiàn)參與RNA加工的SETX；

2004年發(fā)現(xiàn)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運相關(guān)的VAPB；

2006年ANG和CHMP2B加入ALS致病基因家族，前者參與RNA加工，后者與核內(nèi)體轉(zhuǎn)運和自噬相關(guān)。

2008年，另一個重要的ALS相關(guān)基因浮出水面：TARDBP基因編碼的TDP-43 (TAR DNA binding protein 43)。

TDP-43與AD（阿茲海默病）中的tau，PD（帕金森�。┲械�α-syn，HD（亨廷頓�。┲械膆tt并稱“四大惡人”。TARDBP全名是反式反應(yīng)DNA結(jié)合蛋白4（transactive response DNA-binding protein 4），在遺傳性ALS中的占比很�。�家族性占比<5%和散發(fā)性占比<1%）。但高達97%病患的運動皮層和脊髓中都發(fā)現(xiàn)了TDP-43聚集而成的內(nèi)涵體，這些病患中并沒有出現(xiàn)TARDBP的突變，那是怎么回事呢？

罕見病基因：TDP-43

TDP-43平時主要參與mRNA相關(guān)的工作，比如轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以及mRNA的剪切加工、轉(zhuǎn)運或者代謝等。但在ALS研究中，發(fā)現(xiàn)本應(yīng)該在細胞核內(nèi)工作的TDP-43大量涌入細胞質(zhì)，從而導(dǎo)致細胞核內(nèi)“勞動力”不足，TDP-43負責(zé)的mRNA無法加工成成品，同時聚集在細胞質(zhì)中的TDP-43開始躁動，形成內(nèi)涵體，危害神經(jīng)元的正�；顒印�

圖1 TDP-43沉積和ALS的相關(guān)基因的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)^[1]
 

2009年，發(fā)現(xiàn)了FUS（Fused in sarcoma）蛋白和另一個核內(nèi)體轉(zhuǎn)運融合蛋白FIG4。FUS是一個RNA結(jié)合蛋白，它的突變在家族性ALS和散發(fā)性ALS中分別占比4%和1%。針對該蛋白的研究，最開始是在脂肪肉瘤領(lǐng)域，作用和TDP-43有些類似，突變能促使各自蛋白發(fā)生聚集，從而殺死神經(jīng)元。

再往后，SPG11（胞內(nèi)轉(zhuǎn)移酶，與軸突生長相關(guān)），OPTN（自噬相關(guān)），ATXN2（RNA加工），VCP（自噬），SIGMAR1（蛋白酶系統(tǒng)，自噬）和UBQLN2（泛素蛋白酶系統(tǒng)，自噬）等相繼被揪出。其中，UBQLN2（2011年發(fā)現(xiàn)）位于X染色體上，是目前發(fā)現(xiàn)的ALS基因中唯一一個位于性染色體上的基因。

2011年，新發(fā)現(xiàn)的基因中，真正的主角并不是UBQLN2，而是C9ORF72。C9ORF72片段中的內(nèi)含子，有個GGGGCC序列發(fā)生了400-2000次的重復(fù)，而正常該片段的重復(fù)在10次以內(nèi)。這種變異在家族性ALS和散發(fā)性ALS中分別占比36.7%和6.3%，另外在家族性FTD（額顳頁癡呆）中占比25%，所以遺傳性ALS會經(jīng)常出現(xiàn)FTD的癥狀。在延髓性ALS中，C9ORF72相關(guān)的病患比例高達44%。從該基因的命名可看出，目前致病機理還未明確，有少數(shù)報道其參與自噬和內(nèi)涵體運輸。該基因的相關(guān)病患大多在歐美，亞洲絕大部分地區(qū)相當(dāng)罕見。

之后，陸陸續(xù)續(xù)發(fā)現(xiàn)了近10個與ALS相關(guān)的基因，就不一一介紹了。下圖是所有ALS基因的詳情，標(biāo)了顏色是熱點的，沒標(biāo)顏色的目前研究相對較少。

圖2 ALS相關(guān)基因信息列表^[1]  

⭐ 小鼠模型
ALS通過基因編輯或轉(zhuǎn)基因建模比化學(xué)誘導(dǎo)模型靠譜，于是很多ALS轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)運而生。大部分ALS相關(guān)基因是常染色體顯性的，所以讓轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)癥狀并不難

SOD1是最早發(fā)現(xiàn)的，因此相關(guān)的模型小鼠非常多，截至2019年，有接近30種；TARDBP編碼TDP-43相關(guān)的有超過30種；FUS大概接近10種；其余如UBQLN2、VCP和VABP的動物模型則比較少。

那C9ORF72呢？
當(dāng)然有，該基因的外顯子突變是極少的，而致病原因又是內(nèi)含子中的片段重復(fù)，所以一般通過BAC敲入。該基因發(fā)現(xiàn)較晚，但由于與ALS相關(guān)性最高，所以對它的研究很多。

綜合目前多種實驗結(jié)果，科學(xué)家們提出了三種關(guān)于C9ORF72的假說；

❖ 過度重復(fù)的片段造成該蛋白功能的缺失

❖ 這些重復(fù)所轉(zhuǎn)錄的正義和反義RNA產(chǎn)生的毒性

❖ 這六個堿基編碼的二肽重復(fù)蛋白產(chǎn)生的毒性

 
對于動物模型的構(gòu)建，過表達所造成的神經(jīng)元死亡和運動障礙較明顯，可用來模擬中晚期的病情（圖3中綠色箭頭代表）；敲入對小鼠所造成的影響較小，可模擬早中期的病情。

圖3 ALS發(fā)病率^[2]

基因敲除小鼠是研究這些基因功能和ALS深層機理的重要工具。在這些基因中，TDP-43純合敲除小鼠是不可以繁衍的，因為其雜合子表現(xiàn)出對運動神經(jīng)元有一定的保護作用；而SOD1基因敲除小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的外周神經(jīng)疾病。

基因敲入小鼠是將突變后的小鼠基因敲入小鼠，僅僅在小鼠原有基因上進行一兩處堿基突變，就可以表現(xiàn)出很符合的ALS病理特征。如VCPR155H小鼠，在老齡時有50%的運動神經(jīng)元死亡，同時在細胞質(zhì)產(chǎn)生了TDP-43內(nèi)涵體。而總體而言，敲入模型運動能力的減弱較輕微。

人源化小鼠模型隨著近幾年基因編輯技術(shù)的發(fā)展而成為熱點，是在小鼠原有基因的位置上替換人類對應(yīng)的基因。如人源化FUSδ14小鼠，會讓小鼠細胞中的FUS定位發(fā)生紊亂，從而造成運動神經(jīng)元的死亡。

⭐ 參考文獻及引用圖片來源：

[1] Al Sultan A, Waller R, HeathP, Kirby J. The genetics of amyotrophic lateral sclerosis: current insights.Degener Neurol Neuromuscul Dis. 2016;6:49-64

[2] Giorgio F D , Maduro C ,Fisher E M C , et al. Transgenic and physiological mouse models give insightsinto different aspects of amyotrophic lateral sclerosis[J]. Disease Models& Mechanisms, 2019, 12(1):dmm037424.