PCR原理、PCR擴增影響因素及預防詳解

PCR簡介

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR)是利用一段DNA為模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同參與下，將該段DNA擴增至足夠數(shù)量，以便進行結構和功能分析的一種反應。
 

PCR擴增原理

核酸降解是DNA/RNA分子中的堿基和戊糖間的氮糖苷鍵，或磷酸二酯鍵在物理因素、化學因素和生物因素等作用下發(fā)生水解，使DNA/RNA鏈發(fā)生斷裂。

▲ 圖一：PCR原理反應示意圖

▲ 圖二：PCR反應過程中溫度變化圖

實時熒光定量PCR原理

通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時監(jiān)控反應過程，結合相應軟件可以對結果進行分析，通過標準曲線對未知模板進行定量分析，計算待測樣本的初始模板濃度。

▶  初始DNA濃度越高，熒光達到某一值（閾值）時所需要的循環(huán)數(shù)越少（Cq值）。

▶  Log濃度與循環(huán)數(shù)成線性關系，根據(jù)樣品擴增到閾值的循環(huán)數(shù)與已知起始拷貝數(shù)的標準品作出的標準曲線對比就可以計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

影響PCR擴增的因素

▶  模板間的交叉污染。

▶  PCR試劑的污染。

▶  PCR產(chǎn)物的污染。

防止污染的預防操作

❶ 永遠要設置NTC（No Template Control）對照，一個不含有模板DNA但含有PCR體系中所有其他成分的對照。如果不能在污染的第一時間發(fā)現(xiàn)，會導致后續(xù)一系列的數(shù)據(jù)無法使用。

❷ 準備PCR體系的移液器要專用，千萬不能用吸取過PCR產(chǎn)物的移液器去準備PCR體系。

❸ 打開離心管前先離心，開管動作要輕，以防管內液體濺出。

❹ 最好在加完其他反應成分再加入模板。

❺ 實驗結束后及時清理臺面。

出現(xiàn)污染后的解決辦法

❶ 更換試劑：更換新的試劑和水，用確保無污染的移液器分裝備用。

❷ 清潔所有可能的污染源：實驗臺面，離心機，門把手等。

❸ 實驗過程更加小心，采用前面提到的各種防止污染的方法。

Cielo^TM實時熒光定量PCR系統(tǒng)

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