高效液相色譜儀日常維護的方法與步驟

具體維護內(nèi)容

1.流動相

1.1溶劑瓶

a) 棕色玻璃瓶會避免藻類的生長，適用于盛放水及緩沖液相;

b) 流動相應(yīng)經(jīng)過0.45um或更小孔徑的濾器過濾(Waters UPLC使用0.22μm濾膜過濾)，以免其中微粒性阻塞毛細管，使用濾膜時區(qū)別使用有機膜與水膜。

1.2流動相效期的管理

a) 流動相為純有機相的效期為1個月(長時間使用時注意溶液狀態(tài)，使用前觀察是否有絮狀物，瓶體有無沉淀，下同);

b) 有機相比例≥50%，效期為3周;有機相比例為20%~50%效期為2周;有機相比例≤20%效期為1周(長時間使用時注意溶液狀態(tài));

c) 不含有機相的緩沖鹽效期為3天

d) 純化水當(dāng)天配置、使用

1.3溶劑過濾器

Ⅰ溶劑過濾器檢查方法

a) 擰開脫氣機出口或比例閥入口管線，并使液面高于出口30cm此時溶劑會因為重力流出，脫氣機或溶劑過濾頭堵塞時，溶劑會流出不暢或不流出。

b) 查看過濾器是否變色。

c) 臨時取下過濾器，檢查柱前壓力是否正常。

 

a) 玻璃濾頭：將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下，先用水沖洗殘留溶劑，然后將過濾器放在裝有濃硝酸溶液(35%)的燒杯里浸一小時，純水徹底沖洗過濾器。嚴(yán)禁使用超聲波清洗機清洗，將過濾器重新裝好，僅適用于Agilent液相。

b) 金屬濾頭：將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下，先用水沖洗殘留溶劑，然后將過濾器放在50%異丙醇溶液的燒杯里超聲清洗30分鐘，再使用純水超聲清洗2次(每次20min)，清洗后將過濾器重新裝好，適用于Thermo Fisher、Shimadzu、Waters液相。

維護周期：建議每月清洗一次，長時間使用緩沖鹽可適當(dāng)提高清洗頻率。

2.脫氣機

2.1工作原理

真空脫氣機由一個四通道真空箱和一個真空泵，壓力傳感器及控制電路構(gòu)成。

溶劑瓶中的溶劑在泵的抽動下流過真空箱內(nèi)的特殊管狀塑料膜。當(dāng)溶劑經(jīng)過真空管時，溶劑中溶解的氣體將滲過塑料膜進入真空箱。到達真空脫氣機出口時，溶劑幾乎已被完全脫氣而不含有任何氣體。

2.1脫氣機脫氣狀況判斷方法

打開Purge閥(Waters UPLC可設(shè)置為灌注溶劑狀態(tài))，設(shè)定泵的流速2ml/min，提起當(dāng)前所使用溶劑瓶內(nèi)的溶劑過濾頭，使之脫離液面一小段時間，此時溶劑傳送管內(nèi)會產(chǎn)生一小段氣泡，放下過濾頭，讓此段氣泡通過脫氣機，如果脫氣機正常，氣泡應(yīng)消失或縮小。

2.2清洗在線脫氣機及比例閥方法

在長期使用水相或緩沖鹽的通路，使用純水沖洗后，再使用甲醇沖洗，可以打開Purge閥，使用5ml/min的流速(Waters UPLC可設(shè)置為灌注溶劑狀態(tài)) 。污染比較嚴(yán)重時，可以使用異丙醇清洗。

3.四元/二元泵模塊

3.1溶劑比例閥

3.1.1分類

Ⅰ)垂直式比例閥：垂直放置于四元泵中，如Agilent、Thermo Fisher液相。

Thermo Fisher U-3000溶劑比例閥

比例閥A、D通道位于上側(cè)，B、C位于比例閥下側(cè)。因此建議將A通道放入有機相多的溶劑中;B通道放入水相或緩沖液中;C通道放入純有機相中，建議使用乙腈，作為沖洗溶劑;D通道固定放入10%乙腈水溶液中，作為置換溶劑及洗針和灌注注射器。

Agilent 1260溶劑比例閥

比例閥位置是A、D通道位于下側(cè)，B、C位于比例閥上側(cè)。因此建議將A通道放入水相或緩沖液中;B通道放入有機相多的溶劑;C通道放入純有機相中，建議使用乙腈，作為沖洗溶劑;D放入10%乙腈水溶液中，作為置換溶劑。

Ⅱ)水平式比例閥：水平放置于四元泵中，如Waters，Shimadzu液相

水平式比例閥使用

建議通道使用情況與安捷倫一致，A通道放入水相或緩沖液中;B通道放入有機相多的溶劑;C通道放入純有機相中，建議使用乙腈，作為沖洗溶劑;D放入10%乙腈水溶液中，作為置換溶劑。

Ⅲ)二元泵因只有兩個通道，建議A通道放入水相或緩沖液中;B通道放入有機相多的溶劑。

3.1.2溶劑比例閥串液判斷方法

使用兩通連接系統(tǒng)，設(shè)定泵的流速1ml/min，每個通道各占25%流量，提起所有通道的溶劑過濾頭，使之脫離液面一小段時間，此時溶劑傳送管內(nèi)會產(chǎn)生一小段氣泡，放下過濾頭，當(dāng)氣泡至管線中間位置時，關(guān)閉流速，在氣泡處標(biāo)記，只開其中一個通道流速觀察其他三個通道氣泡位置變化，若無變化，則該通道無串液問題，反之存在串液問題，同理檢查其他通道是否存在問題。

3.2柱塞密封清洗

a) 當(dāng)泵頭安裝有清洗附件時，由于該附件中也有密封墊，這樣就會增加活塞桿運動時的阻力，所以開泵前一定先用密封清洗液沖洗柱塞密封墊，濕潤柱塞桿。

b) 建議使用10%異丙醇水溶液(或10%甲醇水溶液)作為密封清洗液，10%異丙醇水溶液(或10%甲醇水溶液)有助于降低水的表面張力，提高潤濕效率，快速溶解析出鹽，并有抑菌作用，有效期為兩周。

c) 實驗開始前確保柱塞密封清洗功能已打開，清洗液不可循環(huán)使用，隨時觀察泵清洗液是否充足，及時添加泵清洗液。

d) 柱塞密封清洗方法

Thermo Fisher、Waters液相內(nèi)置程序自動開啟;

Agilent需要手動打開，設(shè)置定期清洗每30min清洗0.1min;

Shimadzu液相需要手動清洗，使用的島津液相每天使用注射器吸取清洗液沖洗2 min。

4.進樣系統(tǒng)

4.1自動洗針功能

吸取樣品時，進樣閥處于旁路位置，自動洗針可以立即洗去針外表面上殘留的樣品，當(dāng)進樣閥轉(zhuǎn)回到主流路時，定量管和針內(nèi)所有的樣品都被沖洗到色譜柱中。這種結(jié)合洗針和沖洗管路的設(shè)計可以把攜留效應(yīng)減低到最小的程度。

Thermo Fisher、Waters、Shimadzu及AgilentⅡ代液相的自動洗針功能，連接專門通路，自動填充溶劑清洗;AgilentⅠ代液相采用在液相小瓶中清洗的方式，需要設(shè)置清洗小瓶位置并且去掉小瓶的蓋墊，防止少量樣品留在密封墊上，造成污染。

洗針液以能溶解待測樣品為宜，可有效減少殘留污染。建議使用10%的甲醇或乙腈作為洗針液，Thermo Fisher液相使用D通道，即10%乙腈作為洗針液，對于特殊樣品需要配制專門溶劑。

4.2計量裝置

a)Thermo Fisher、Waters、Shimadzu液相采用計量注射器量取樣品液，在運行前需要灌注注射器以排除注射器內(nèi)氣泡，以防計量不準(zhǔn);

b)Agilent液相采用計量泵方式，無注射器不需灌注。

 

 

5色譜柱

反相色譜柱維護，通常使用純水和有機溶劑，水主要是作為沖洗掉色譜柱中的鹽和其他添加劑，而有機溶劑則是用來沖洗掉一些在色譜柱上有較強保留的污染物;

完全置換色譜柱中的流動相，需要至少十倍柱體積，一根常用的4.6×150mm和4.6×250mm的色譜柱柱體積大約分別是1.5mL、2.5ml，按照常用的1mL/min的流速，分別至少需要15min、25min的時間。

6紫外檢測器

 

 

6.1流通池的清洗

在不連接色譜柱的情況下先用高純水沖洗20分鐘，然后用異丙醇(或5%硝酸，流通池污染嚴(yán)重時采用，慎用))沖洗2小時，最后用高純水沖洗，可根據(jù)污染情況調(diào)整沖洗時間，若正常沖洗無效，反沖檢測器。適用于VWD、DAD的流通池。

6.2流通池耐壓

注意不同檢測器流通池耐壓問題，盡量避免使用pH>9.5的流動相，以防腐蝕流通池石英窗，避免使用可能析晶的流動相，防止流通池堵塞;VWD 40bar，DAD 120bar，MWD 120bar，F(xiàn)LD熒光 20bar，RID 示差5bar，RID、FLD永遠是最后一個檢測器。

6.3檢測器燈維護

檢測器的燈一般在流通池有溶液連續(xù)流出幾分鐘后再開啟，若流通池中有氣泡，則會提示漂移過大無法通過自檢和校正;

檢測器的氘燈或鎢燈不可經(jīng)常關(guān)閉，每開關(guān)一次燈的壽命損失約30小時，若儀器中途不需做樣，可設(shè)置低流速，長時間不使用可關(guān)機。

7色譜系統(tǒng)

7.1儀器的過渡及流動相的過渡處理

a)使用儀器前，使用10%乙腈沖洗系統(tǒng)10~30min，當(dāng)流動相含緩沖鹽時，連接色譜柱，繼續(xù)使用10%乙腈沖洗系統(tǒng)約20min(根據(jù)柱體積來確定過度時間，至少10倍柱體積)，以置換色譜柱內(nèi)保存液;

b)Purge注意事項

更換所需流動相，若流動相分別使用緩沖鹽和純有機相兩個通道時，當(dāng)purge完其中一個通道后，使用10%乙腈purge 2 min左右，再purge另外的一個通道，放置防止水相與有機相在比例閥至泵后管路中混合產(chǎn)生結(jié)晶堵塞管路;將兩通道比例設(shè)置完成后關(guān)閉purge閥，開始平衡色譜柱;

c)儀器使用后，首先將使用到的管路放入10%乙腈中，使用10%乙腈沖洗色譜系統(tǒng)30~50min，更換為90%乙腈沖洗30min，使用兩通替換色譜柱，將四個通道放入10%乙腈中或50%異丙醇中沖洗保存。

7.2儀器的清洗維護

a)液相的四個通道使用50%異丙醇沖洗過夜，在沖洗過程中每隔一段時間切換進樣閥的主路和旁路，用于清洗六通閥，長時間未清洗的儀器可以適當(dāng)提高異丙醇比例。

b)當(dāng)進樣的樣品濃度較高時，設(shè)置洗針序列，進樣10%有機相(可根據(jù)樣品溶解度選擇合適的洗液，一般不含鹽)，兩分鐘進樣一次，運行10針以上，可以沖洗干凈。

7.3色譜用溶液、溶劑污染防范

a)各(色譜)試劑只能倒出，不得用器具移取或者將剩余倒回;

b)將甲醇、乙腈可倒入小體積溶劑瓶或燒杯中，方便使用且避免污染;

c)當(dāng)稀釋劑中含有機相時，避免使用塑料滴管，防止有機相溶解塑料在色譜系統(tǒng)中產(chǎn)生鬼峰;

d)溶劑瓶注意封口，當(dāng)兩個通道放入一個瓶中時，使用封口膜密封，防止異物(注意封口膜老化掉入)落入其中。

7.4捕集小柱使用注意

捕集小柱可有效避免流動相中的雜質(zhì)對基線的干擾，主要應(yīng)用于梯度洗脫體系中;

沖洗過渡色譜系統(tǒng)后，首先使用梯度流動相中有機相比例最大的比例沖洗系統(tǒng)至基線平衡，再更換為初始比例，時間為梯度中設(shè)置的平衡時間，不管是否平衡，立即運行序列，空白進至少3針保證系統(tǒng)平衡。

7.5常見問題解析

保留時間不穩(wěn)定

a)首先觀察保留時間是否有規(guī)律的變化，并同時觀察壓力是否穩(wěn)定;

b)若壓力穩(wěn)定而保留時間呈有規(guī)律變化，多數(shù)是色譜柱未平衡好，特別是含有鹽的流動相，需較長的時間去平衡;

c)若壓力穩(wěn)定而保留時間無規(guī)律變化，請檢查溶劑過濾頭及真空腔是否有堵塞，再平衡色譜柱足夠時間，如仍然不佳，可更換一色譜柱;

d)若壓力不穩(wěn)定，請檢查造成壓力不穩(wěn)定的因素，如：漏液，排液時間不足夠，鹽濃度過高導(dǎo)致鹽析，主動閥比例閥內(nèi)漏等。

峰面積重現(xiàn)性不好

a)首先觀察壓力是否穩(wěn)定，以及觀察峰面積變化是否有規(guī)律。

b)若壓力不穩(wěn)定，請檢查造成壓力不穩(wěn)定的因素，如漏液，排液時間不足夠，鹽濃度過高導(dǎo)致鹽析，主動閥比例閥內(nèi)漏等;

c)若壓力穩(wěn)定但峰面積呈無規(guī)律變化。請檢查樣品是否足夠，確認(rèn)樣品的穩(wěn)定性，必要時重新配制，檢查進樣閥是否漏液等;

d)若壓力穩(wěn)定且峰面積呈規(guī)律變化，多數(shù)為色譜柱未平衡好。

基線不穩(wěn)定

a)基線漂移

色譜柱未平衡好，柱溫未穩(wěn)定，流動相變化等。

b)基線噪音

流動池有氣泡，流通池污染;

色譜柱和或系統(tǒng)受污染;

燈能量不足，光路臟;

外界因素影響，如電源，溫度和濕度、震動等。