Minibox平行生物反應(yīng)器在提高菌株生產(chǎn)魯棒性研究上的應(yīng)用

微生物產(chǎn)業(yè)是國家戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)。國家發(fā)展改革委于5月10日發(fā)布了《“十四五”生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展規(guī)劃》，明確了生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展的具體任務(wù)是推動生物燃料與生物化工融合發(fā)展。
美國制定了《生物質(zhì)技術(shù)路線圖》（2002年），計劃到2030年，生物基產(chǎn)品替代有機化學(xué)品的比例達(dá)到25%，生物能源替代運輸用石油燃料的比例達(dá)到20%，相關(guān)產(chǎn)品絕大部分來自微生物制造；基于微生物生產(chǎn)化學(xué)品和燃料的產(chǎn)業(yè)正不斷增長，并且在全球經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮著越來越重要的作用，其在美國就占到了國民生產(chǎn)總值（GDP）的2%以上。
然而，微生物在工業(yè)生產(chǎn)過程中會遭遇到多種逆境壓力，例如高溫、低溫、酸、氧化、滲透壓力或者營養(yǎng)缺乏，會影響細(xì)胞生長和生產(chǎn)能力，導(dǎo)致減產(chǎn)。比如在氨基酸或有機酸生產(chǎn)中，酸性代謝物在發(fā)酵培養(yǎng)基中的逐漸積累會使菌株遭受酸壓力。盡管可以通過在培養(yǎng)基中添加堿性物質(zhì)來減少酸壓力產(chǎn)生的負(fù)面影響，但同時也將增加下游分離成本、廢水和固廢的排放。

細(xì)胞對環(huán)境壓力的耐受性改造工程一直是生物制造業(yè)需要解決的關(guān)鍵問題。因此，科學(xué)家們提出對耐酸菌株的設(shè)計和篩選將會是一種更智能和更具成本效益的解決方案。雖然合成生物學(xué)理論上為設(shè)計這種耐受菌株提供了多種基因組進(jìn)化策略，但難以從數(shù)百個與壓力相關(guān)的基因中選擇出少數(shù)關(guān)鍵基因，組裝成有效的抗逆模塊。近期，在《Microbial Cell Factories》雜志上發(fā)表的文章“Synthetic acid stress-tolerance modules improve growth robustness and lysine productivity of industrial Escherichia coli in fermentation at low pH ”中，華南理工大學(xué)聯(lián)合中糧營養(yǎng)與健康研究院、上海交通大學(xué)研究團(tuán)隊巧妙地設(shè)計了一組合成抗酸模塊，通過微調(diào)少數(shù)基因的表達(dá)量即可有效提高菌株的酸耐受性。該模塊由質(zhì)子消耗系統(tǒng)基因（gadE），蛋白質(zhì)保護(hù)與質(zhì)量控制系統(tǒng)基因（hdeB）和抗氧化酶系統(tǒng)基因（sodB和katE）組成，并通過酸響應(yīng)啟動子進(jìn)行調(diào)控。
首先，研究者們使用定向進(jìn)化的方法，對酸響應(yīng)性酸性休克RNA（asr）的啟動子進(jìn)行改造，構(gòu)建酸響應(yīng)性asr啟動子突變庫，基于熒光蛋白的表達(dá)進(jìn)行篩選獲得49個不同強度的酸響應(yīng)asr啟動子。從中選擇四種變體具有不同強度的啟動子突變體以實現(xiàn)基因的適量表達(dá)，從而構(gòu)建一系列的合成抗酸模塊。
進(jìn)一步，為了研究所選基因在中度酸性（pH 5.0）環(huán)境下對大腸桿菌耐酸性的影響，分別對gadE、hdeB、sodB、katE和katE-sodB進(jìn)行單獨過表達(dá)的酸生長測試（如下所示）。接著，在4種不同強度的asr啟動子突變體P24E8、P10G6、P77C4和P50G1的控制下，組裝4個基因gadE、hdeB、sodB、katE構(gòu)建合成抗酸模塊。 為了評估合成抗酸模塊是否能提高工業(yè)大腸桿菌的生產(chǎn)性能，研究者建立了大腸桿菌抗酸模塊逐級評估方法，對合成抗酸模塊進(jìn)行從實驗室菌株、實驗室培養(yǎng)基到工業(yè)生產(chǎn)菌株、工業(yè)培養(yǎng)基條件下的性能評估。首先使用實驗室測試菌株E. coli MG1655在微孔板中（一次可測試200個樣）進(jìn)行生長測試，然后使用工業(yè)賴氨酸生產(chǎn)菌株E. coli MG1655 SCEcL3在10-mL微生物反應(yīng)器中（一次可測試24個樣）進(jìn)行微型發(fā)酵篩選測試。
最后在1.3-L x 8組的平行生物反應(yīng)器（Minibox，T&J 迪必爾生物工程（上海）有限公司）中測試合成抗酸模塊對賴氨酸生產(chǎn)性能的影響。在Minibox 1.3-L x 8組的平行生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中，首先將細(xì)胞在種子培養(yǎng)基中活化，以1%（v / v）接種量接種到含有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，在搖床中37°C、250 rpm培養(yǎng)到OD600為2.0-3.0，然后將75 mL種子液接種到含425 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1.3-L平行生物反應(yīng)器中。在線監(jiān)測DO、pH和溫度。通過流加5%（w / v）氨水將培養(yǎng)基的pH值控制在6.8或6.0。在48 h發(fā)酵期間，DO、溫度和葡萄糖分別控制在40-60%，37.0 ± 0.1°C和0.4-1.0%（w / v）。并通過調(diào)節(jié)攪拌速率從200到1000 rpm進(jìn)行控制，通氣速率為0.5 vvm。定期采集樣品以測量光密度，殘留葡萄糖和賴氨酸產(chǎn)量。
使用Minibox平行反應(yīng)器大大加速了研發(fā)進(jìn)程，最終篩選得到能最大提高菌株生產(chǎn)性能的合成抗酸模塊，使工程菌株在pH 6.0下的產(chǎn)量與pH 6.8下的親本菌株產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率相當(dāng)，菌株耐酸性能得到提高。

該研究構(gòu)建了酸響應(yīng)啟動子庫，構(gòu)建了含有限4個基因構(gòu)成的合成抗酸模塊，并發(fā)展了抗酸模塊逐級評估方法，實現(xiàn)了賴氨酸工業(yè)生產(chǎn)菌株耐酸性能的有效提升（耐受pH值下降1個單位），為提高工業(yè)微生物抗逆性的研究提供了新的思路，并且豐富了合成生物學(xué)元器件庫。

參考文獻(xiàn)：

1.  Yao, X., Liu, P., Chen, B. et al. Syntheticacid stress-tolerance modules improve growth robustness and lysine productivityof industrial Escherichia coli in fermentation at lowpH. Microb Cell Fact 21, 68 (2022).https://doi.org/10.1186/s12934-022-01795-4