高通量菌落篩選工作站ROTOR在基因工程和過程設(shè)計(jì)中的應(yīng)用

萊茵衣藻作為單細(xì)胞真核綠藻,具有生長周期短,實(shí)驗(yàn)操作簡便,只具有一個(gè)較大的葉綠體,易獲得各種突變體等優(yōu)點(diǎn),是國際上用于研究植物細(xì)胞分子生物學(xué)和光合作用遺傳的理想模式材料。萊茵衣藻的遺傳轉(zhuǎn)化為獲得大量突變體,并分離導(dǎo)致突變的基因以及研究其功能等提供了很有效的手段。

近日，Kyle Lauersen教授領(lǐng)導(dǎo)的阿卜杜拉國王科技大學(xué)(KAUST)生物與環(huán)境科學(xué)學(xué)院(BESE)合成生物學(xué)組(SSB)開展了一項(xiàng)通過基因工程和過程設(shè)計(jì)，開發(fā)資源高效的生物工藝。



在整個(gè)實(shí)驗(yàn)研究中，SINGER的高通量菌落篩選工作站ROTOR和高精度菌落挑取工作站PIXL發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

Kyle教授的實(shí)驗(yàn)室致力于合成生物學(xué)在光合生物中的應(yīng)用，其主要工作對(duì)象是一種細(xì)胞壁缺陷的綠色真核藻類——萊茵衣藻。綠藻是通過光合作用生長的神奇生物，這意味著它們利用(太陽光)作為能量，并捕獲二氧化碳作為碳源。



通過將植物和真菌等其他生物的途徑引入藻類，可以定制藻類的新陳代謝，從而產(chǎn)生非天然化合物。一旦引入成功，這些途徑就會(huì)改變天然代謝途徑，全部從二氧化碳產(chǎn)生感興趣的產(chǎn)物。

盡管自20世紀(jì)40年代以來，這種綠藻一直在實(shí)驗(yàn)室里培育，但它有著復(fù)雜的基因。自2015年以來，Kyle團(tuán)隊(duì)就已經(jīng)知道如何利用生物體的天然基因調(diào)節(jié)機(jī)制可靠地表達(dá)其核基因組中的轉(zhuǎn)基因。然而，改造藻類是一個(gè)數(shù)字游戲，因?yàn)镈NA隨機(jī)地整合到基因組中，導(dǎo)致整個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞群體的一系列表達(dá)，所以需要篩選成百上千個(gè)轉(zhuǎn)化株來尋找符合要求的目標(biāo)株。

原始的工作流程是用牙簽手工挑取轉(zhuǎn)化的菌落。可以想象，這是一個(gè)非常乏味的過程，當(dāng)有20種不同的質(zhì)粒要嘗試時(shí)，研究組的每個(gè)學(xué)生手動(dòng)挑選成百上千個(gè)菌落，可能需要連續(xù)多天不停的工作。



高精度菌落挑取工作站PIXL直接將通量提高了8倍以上。除此之外，由機(jī)器人點(diǎn)種的標(biāo)準(zhǔn)化菌落陣列在質(zhì)量和可重復(fù)性上都遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于手工操作，機(jī)器比人工可以在單位面積上接種更多的菌落，因此可以在相同的面積上得到更多的菌落，這樣能夠減少培養(yǎng)基的使用。手工做的最大限度是每個(gè)13×13厘米平板接種144個(gè)菌落，而PIXL可以輕松地把384個(gè)菌落接種在小矩形板上，1000多個(gè)菌落只需一小時(shí)就能完成�。�

藻類菌落不是通過簡單的冷凍來儲(chǔ)存的，而是把文庫保存在瓊脂板上，每兩周或每個(gè)月轉(zhuǎn)接一次。高通量菌落篩選工作站ROTOR可以快速、無菌、可靠的在瓊脂間轉(zhuǎn)接和保存菌落。



這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的另一個(gè)流程是使用PCR板作為背景，將菌落從一個(gè)瓊脂板轉(zhuǎn)移到另一個(gè)瓊脂板，這顯然有其局限性，一方面是有可能人為失誤，另一方面是單次只能轉(zhuǎn)移96個(gè)菌落。而ROTOR消除了轉(zhuǎn)接過程中所有的人工誤差，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)更高密度的菌落轉(zhuǎn)移，也可以用長針快速接種至96/384孔液體平板。標(biāo)準(zhǔn)化還使我們能夠加快分析瓊脂平板上的菌落特征。

Kyle團(tuán)隊(duì)的實(shí)驗(yàn)取得了階段性的成果，也對(duì)這兩款儀器的評(píng)價(jià)很高。Kyle說：“ROTOR和PIXL已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室里運(yùn)行了6個(gè)月，它們的組合，在通量和重現(xiàn)性方面將引領(lǐng)實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化操作的變革。”