高通量菌落篩選工作站ROTOR+在深入研究新冠病毒中的應(yīng)用

新型冠狀病毒肺炎疫情已經(jīng)在全球肆虐兩年。兩年間，奪去了數(shù)萬(wàn)條生命，讓無(wú)數(shù)家庭失去親人，讓人們的生活支離破碎的病毒，還在不斷地繁衍和變化。

COVID-19是由SARS-CoV-2冠狀病毒感染引起的呼吸系統(tǒng)綜合征，在世界范圍內(nèi)已造成超過(guò)120萬(wàn)人死亡，給許多國(guó)家醫(yī)療設(shè)施造成了巨大的壓力，并在世界范圍內(nèi)造成了重大的經(jīng)濟(jì)影響。SARS-CoV-2病毒是一種人畜共患冠狀病毒，可以通過(guò)呼吸道飛沫和氣溶膠迅速傳播。在過(guò)去20年里，由冠狀病毒引起的另外兩種主要呼吸綜合征，SARS和MERS也相繼出現(xiàn)。因此，新型冠狀病毒感染有可能會(huì)持續(xù)威脅人類(lèi)健康。



冠狀病毒是巢狀病毒目中的包膜正鏈RNA病毒。所有冠狀病毒都含有一種通過(guò)包膜的刺突蛋白，它對(duì)宿主受體結(jié)合和感染非常重要，并使這些病毒在電子顯微照片中呈現(xiàn)冠狀外觀。冠狀病毒包含的基因組是所有正鏈RNA病毒中最大的，約為30Kb，部分原因是它編碼了一種RNA外切酶，在基因組復(fù)制過(guò)程中起校對(duì)作用。病毒基因組的前三分之二被翻譯成兩個(gè)大的多聚蛋白，通過(guò)病毒編碼的蛋白酶作用加工成單個(gè)的非結(jié)構(gòu)蛋白。這些非結(jié)構(gòu)蛋白重組宿主的膜結(jié)構(gòu)，形成病毒復(fù)制酶。 

盡管在過(guò)去10個(gè)月里，通過(guò)大量的研究，我們對(duì)SARS-CoV-2病毒了解了很多，但要抗擊這種病毒以及可能出現(xiàn)的新型傳染性變異冠狀病毒，還需要研究更多。酵母可以作為一個(gè)靈活的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，幫助安全地研究新冠病毒。雖然在酵母中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)正鏈RNA病毒，但已經(jīng)有幾種正鏈RNA病毒復(fù)制系統(tǒng)建立起來(lái)，通過(guò)酵母啟動(dòng)子表達(dá)病毒RNA。來(lái)自SARS-CoV-2的單個(gè)病毒蛋白也已在酵母中表達(dá)，以確定真核生物常見(jiàn)的遺傳相互作用。此外，病毒蛋白已在酵母中表達(dá)，作為一種鑒定病毒蛋白的酶活性以及評(píng)估這些活性抑制劑的一種方式。 



研究員使用Singer公司的高通量菌落篩選工作站（ROTOR+）篩選病毒-宿主基因相互作用的酵母基因損傷庫(kù)（yeast gene disruptionlibrary）。通過(guò)SPA（SelectivePloidy Ablation，一種高通量的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移方法）酵母交配的方法，將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到陣列酵母文庫(kù)。該方法依賴(lài)于供體菌株的所有16個(gè)酵母染色體，包含著絲粒近端反選標(biāo)記(URA3)和GAL1基因的半乳糖誘導(dǎo)蛋白啟動(dòng)子。在有絲分裂期間，這些菌株的半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)和著絲粒功能破壞，導(dǎo)致染色體缺失。在單倍體環(huán)境下，這種菌株在半乳糖環(huán)境下生長(zhǎng)時(shí)會(huì)死亡。在二倍體雜合的CEN標(biāo)記的染色體中，半乳糖上生長(zhǎng)導(dǎo)致CEN標(biāo)記染色體和所有伴隨的遺傳信息的特異性丟失。因此，所有16條染色體的雜合二倍體可以簡(jiǎn)單地在半乳糖上通過(guò)有絲分裂生長(zhǎng)成為單倍體。



高通量菌落篩選工作站ROTOR+，可以使用SPA方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到菌株庫(kù)中。用含有感興趣病毒基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化SPA供體菌株，用st作為選擇標(biāo)記。轉(zhuǎn)化株在營(yíng)養(yǎng)缺失的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜，然后在SingerPlusPlates™的YPD培養(yǎng)基上涂布，形成菌膜。兩種交配型的兼容酵母庫(kù)被點(diǎn)種在YPD上，兩套培養(yǎng)皿都生長(zhǎng)過(guò)夜。接下來(lái)菌膜和文庫(kù)排列被點(diǎn)種在一起進(jìn)行交配，在YPD上生長(zhǎng)6-8小時(shí)以交配，然后點(diǎn)種在含有半乳糖作為碳源的亮氨酸缺失培養(yǎng)基上。平板在30°C半乳糖上孵育2天，以使供體菌株染色體不穩(wěn)定，然后點(diǎn)種在含有半乳糖和5-氟乳酸(5-FOA)的亮氨酸缺失培養(yǎng)基上，以反選仍然含有供體染色體的活性菌株。用Singer PhenoBooth+成像前，在5-FOA上孵育2-3天，進(jìn)行單倍體生長(zhǎng)。將含有病毒表達(dá)質(zhì)粒的菌落與空載體對(duì)照進(jìn)行比較，以確定在酵母突變體文庫(kù)中的適應(yīng)性。



ROTOR+允許試劑設(shè)置諸如基因缺失變異株采集、使用大規(guī)模二倍體基因陣列全套克隆酵母基因、表型和化學(xué)基因分析。RoToR 使用塑料板墊，支持液體點(diǎn)種至96/384孔板或以96、384、768、1536、3072和6144的密度點(diǎn)種至瓊脂板上。SPA篩選過(guò)程是高效的，因?yàn)樗�可以迅速交配轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，不需要孢子形成和單倍體選擇。全基因組掃描可以在六天內(nèi)完成。