Elispot在COVID-19新冠疫苗研發(fā)的應(yīng)用

研究顯示：代謝紊亂與嚴(yán)重COVID-19的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。

COVID-19患者血清中葡萄糖含量的增加與患有和未患有糖尿病的個(gè)體預(yù)后不良相關(guān)（Shen 等人，2020 年）。在細(xì)胞水平上，SARS-CoV-2 誘導(dǎo)宿主細(xì)胞代謝向受感染細(xì)胞中的糖酵解轉(zhuǎn)變，以及針對(duì)己糖激酶（糖酵解中的限速酶）的糖酵解抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖 (2DG))，干擾結(jié)腸腺癌細(xì)胞 (Caco-2) 細(xì)胞和單核細(xì)胞中的 SARS-CoV-2 感染（Bojkova 等人，2020 年；Codo 等人，2020 年）。因此，拮抗病毒引起的宿主細(xì)胞代謝變化，尤其是糖酵解的藥物是COVID-19治療的候選藥物。

此次試驗(yàn)采用的是Elispot技術(shù)（酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)法），并通過Bioreader®-7000-FzI (Bio-Sys) 對(duì)尖峰陽性區(qū)域進(jìn)行定量。

ELISPOT之于疫苗開發(fā)

在新冠狀病毒肆虐的當(dāng)下，國內(nèi)外針對(duì)新冠狀病毒的疫苗研發(fā)正爭(zhēng)分奪秒的進(jìn)行，在疫苗效果評(píng)價(jià)中，有很多權(quán)威期刊文章中指出使用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)疫苗的細(xì)胞免疫功能是重要的技術(shù)手段并已得到廣泛使用。
中國藥品生物制品檢定所在 2003年發(fā)布的《預(yù)防用以病毒為載體的活疫苗制劑的技術(shù)指標(biāo)原則》中明確指明：“使用ELISPOT方法檢測(cè)淋巴細(xì)胞分泌γ干擾素功能，作為檢測(cè)和評(píng)價(jià)疫苗的細(xì)胞免疫的有效方法”。
此外，世界衛(wèi)生組織在艾滋病(HIV)疫苗的研究中，也推薦使用ELISPOT檢測(cè)淋巴細(xì)胞分泌γ干擾素功能（WHO-UNAIDS-sponsored training workshop 2003）。

ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）全名為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)，是利用預(yù)先包被好抗原或抗體的微量板從單細(xì)胞水平檢測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞或特異性細(xì)胞因子(cytokine,CK)分泌細(xì)胞的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。1983年，Sedgwick和 Czerkinsky 等根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的基本原理結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，建立并首先報(bào)道了這種新技術(shù)，用于檢測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞。1988 年該方法被首次用于檢測(cè) IFN-γ分泌細(xì)胞。
簡(jiǎn)單來說，就是用在PVDF 膜為底的孔板上包被好的抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的方式將其呈現(xiàn)出來。

ELISPOT技術(shù)的基本步驟為:

(1) 用抗待檢細(xì)胞因子的高親和力的單克隆抗體包被96孔板,然后用1%牛血清蛋白37℃封閉2 h, 阻止非特異性蛋白的吸附。

(2) 將細(xì)胞和刺激劑加到孔中孵育一段時(shí)間, 此時(shí)活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。

(3) 洗去多余的細(xì)胞。

(4) 加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體。

(5) 加入酶標(biāo)記的鏈親和素, 加入底物溶液顯色檢測(cè)抗體細(xì)胞因子復(fù)合物。

數(shù)據(jù)檢測(cè)和分析

通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可使用BIO-SYS Bioreader對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，進(jìn)行高通量篩選，檢測(cè)效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它方法。

關(guān)于BIO-SYS\Bioreader

由德國BIO-SYS有限公司研制，擁有專利的雙遠(yuǎn)心照明系統(tǒng)，通過使用“光度”強(qiáng)度照明和梯度來區(qū)分真/假點(diǎn)。
 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果輸出：

參考文獻(xiàn)：

Bojkova D, Costa R, Reus P, Bechtel M, Jaboreck MC, Olmer R, Martin U, Ciesek S, Michaelis M, Cinatl J Jr. Targeting the Pentose Phosphate Pathway for SARS-CoV-2 Therapy. Metabolites. 2021 Oct 13;11(10):699. doi: 10.3390/metabo11100699. PMID: 34677415; PMCID: PMC8540749.