使用SYBR Green熒光染料進行熒光定量pcr檢測的原理步驟

SYBR Green熒光染料是 dsDNA 結(jié)合染料。在它與dsDNA ，結(jié)合后熒光會增加一百倍以上（圖 8a）。雖然它在一定程度上與 PCR 兼容，但在較高的濃度下會 抑制 PCR 反應(yīng)。在 LightCycler 儀器中，SYBR 通常 在通道 F1 中顯現(xiàn)。SYBR 的優(yōu)點是它可以與任何 dsDNA 結(jié)合；無需設(shè)計和優(yōu)化探針�？梢杂行�提高定量PCR的效率，當熒光染料 SYBR Green I 與 DNA 雙螺旋結(jié)合時，在溶液中，未結(jié)合的染料顯示出較小的熒光，而當它與DNA 結(jié)合后熒光就會急劇增強。

由于 SYBR Green I 染料較為穩(wěn)定（在 30 次擴增循環(huán)中僅損失 6% 的活性）并且 LightCycler 儀器的濾光片組與激發(fā)和發(fā)射波長相匹配，所以它常常被用于測量總 DNA 。

SYBR Green I 染料在PCR檢測中的步驟原理：
原理如下圖所示。
在擴增開始時，反應(yīng)混合物含有變性的 DNA、引物和染料。未結(jié)合的染料分子發(fā)出微弱的熒光，產(chǎn)生最小的背景熒光信號，在計算機分析過程中將其減去。
   
引物退火后，一些染料分子可以與雙鏈結(jié)合。DNA 結(jié)合導(dǎo)致 SYBR Green熒光染料分子在激發(fā)時發(fā)光顯著增加。

 
 
在延伸過程中，越來越多的染料分子與新合成的 DNA 結(jié)合。如果連續(xù)監(jiān)測反應(yīng)，可以實時觀察熒光的增加。在 DNA 變性進行下一個加熱循環(huán)時，染料分子被釋放，熒光信號下降。
 
在每個 PCR 循環(huán)的延伸步驟結(jié)束時進行熒光測量，以監(jiān)測擴增 DNA 的增加量。SYBR Green I 格式與 PCR 之后進行的熔解曲線分析一起，為特定產(chǎn)品的鑒定和定量提供了有利的驗證。
 
SYBR Green I (SG) 作為嵌入型染料廣泛用于實時 PCR 應(yīng)用，并以未公開的濃度包含在許多市售試劑盒中。SG 與雙鏈DNA 的結(jié)合是非特異性的，需要額外的測試，例如 DNA 熔解曲線分析，以確認特異性擴增子的產(chǎn)生。熔解曲線分析的使用消除了瓊脂糖凝膠電泳的必要性，因為特定擴增子的熔解溫度 (Tm)類似于電泳條帶的檢測。當使用 SG 進行實時 PCR 多重反應(yīng)時，只要 Tm 值足夠，應(yīng)該可以區(qū)分擴增子不同的。

使用市售試劑盒和內(nèi)部 SG 預(yù)混液對霍亂弧菌和嗜肺團菌進行的實時多重檢測強調(diào)了性能特征的可變性，特別是僅檢測到 Tm 分析評估的單一產(chǎn)品，但檢測到瓊脂糖凝膠評估的多個產(chǎn)品電泳。檢測到的 Tm 對應(yīng)于具有更高 G+C% 和更大尺寸的擴增子，表明在 PCR 期間 SG 優(yōu)先結(jié)合，并導(dǎo)致當存在的 SG 數(shù)量有限時無法在多重反應(yīng)中檢測到多個擴增子。這對使用SYBR Green熒光染料 SG診斷實時 PCR 檢測的設(shè)計和常規(guī)應(yīng)用具有影響。