MaxCyte電轉(zhuǎn)平臺助力ExPERT非病毒CAR-T細胞生產(chǎn)工藝突破產(chǎn)業(yè)瓶頸
CAR-T是當下最受關(guān)注的血液腫瘤細胞療法，如何高效、快速、安全地制備CAR-T細胞，是急待解決的技術(shù)瓶頸之一。目前開發(fā)一種高效、快速、多功能和安全的基因工具來構(gòu)建重組T細胞的需求日益迫切，mRNA-CAR被認為是一種快速安全，低成本的解決方案。但通過mRNA轉(zhuǎn)染的CAR基因工程雖然能克服載體風險，但只能提供瞬時表達。德國癌癥研究中心的科學(xué)家們開發(fā)了這種安全快速且持久表達的、非病毒非整合型的DNA載體平臺、能夠在臨床規(guī)模的封閉體系中快速制備CAR-T細胞。
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作者整合先進的自動化設(shè)備，構(gòu)建了一套CAR-T細胞生產(chǎn)線路：利用德國美天旎的CliniMacs系統(tǒng)純化采集的T細胞，利用全自動細胞培養(yǎng)系統(tǒng)， GTx ExPERT (MaxCyte)大規(guī)模流式電轉(zhuǎn)系統(tǒng)，能夠在5天時間內(nèi)從10.35 × 109 個血液細胞中純化出1 × 109 個T細胞，并最終獲得3.6 × 108個經(jīng)過驗證具有功能的CAR-T細胞。MaxCyte GTx是符合cGMP規(guī)范的電轉(zhuǎn)平臺，是真正經(jīng)過廣泛驗證的密閉轉(zhuǎn)染平臺，容易整合到自動化工業(yè)產(chǎn)線中，滿足早期研發(fā)到臨床及商業(yè)化全流程，已經(jīng)支持了全球超過100項細胞和基因治療臨床項目，被Kite、CRISPR、Editas、Sangoma等全球頂尖的生物技術(shù)公司采用，如果這一系列最后能夠商品化，將必然給CAR-T細胞治療的開發(fā)和推廣應(yīng)用帶來巨大深遠的影響。
選擇nano-S/MARt作為載體
研究人員開發(fā)了一種納米s/MARt (nS/MARt)載體，能在給T細胞活性造成最小的破壞的同時提供穩(wěn)定的表達。這種新的DNA載體平臺是基于支架/基質(zhì)附著區(qū)(S/MAR)基序，可以積極介導(dǎo)有絲分裂活性細胞中DNA載體復(fù)制和游離體episome的維持。nS/MARt載體可以有效地轉(zhuǎn)染到原代人T細胞中而不產(chǎn)生毒性。這種新的DNA載體系統(tǒng)是基于無抗生素納米載體技術(shù);不含免疫原性和成分，只包含臨床批準的序列，可實現(xiàn)簡單輕松、更具性價比的CAR-T細胞制備。結(jié)合研究人員優(yōu)化的流式電穿孔和自動化的細胞培養(yǎng)，他們還提供了一種適應(yīng)臨床規(guī)模的封閉生產(chǎn)流程，最終實現(xiàn)從1×109的T細胞中生產(chǎn)出6×108 的重組T細胞，其中55%能穩(wěn)定表達CAR，從純化T細胞起只需5天時間完成！——這將是推動CAR-T細胞療法朝著更可持續(xù)和更普及的方向邁出的重要一步。
實驗設(shè)計與結(jié)果
作者首先選擇了一個DNA載體pEPI，去除了非必需元件，將載體從3kb縮小到1.5kb。第一輪改造得到一個功能提高、能在HEK 293T和 HeLa細胞中穩(wěn)定表達的載體 pS/MARt。然后通過引入剪切位點去掉了來自S/MAR非必需的序列和ARE，獲得了更穩(wěn)定的SP-nS/MARt-B 載體。研究人員再用來自載脂蛋白apolipoprotein B (ApoB)的更緊湊形式S/MAR替換了IFN-β S/MAR，通過實驗證實最后版本的SP-nS/MARt-A 納米載體是最佳的，不但轉(zhuǎn)染效率最高，產(chǎn)生克隆最多，GFP表達最強（轉(zhuǎn)染24小時后）。這還沒完，研究人員用來自人EF1α 啟動子替換掉了CMV啟動子，把最后一點病毒序列也去掉了。在Jurkat76 (J76) 細胞中證實，新載體能持續(xù)穩(wěn)定表達，80%的活細胞都能表達報告基因。更強的是，研究人員分離出表達GFP的細胞，培養(yǎng)360天后依然能檢測到GFP穩(wěn)定表達，每個細胞有1.71個游離性拷貝，超長待機，還不會整合到染色體上。轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)染對照細胞的增殖沒有明顯區(qū)別，表明載體對細胞毒性影響很小，也不會改變CD4和CD8比例。用pEPI載體對照轉(zhuǎn)染27天后GFP幾乎都消失而SP-nS/MARt-A轉(zhuǎn)染的仍有40%具有GFP表達。這些都表明，新載體用于制備CAR-T細胞應(yīng)該非常有優(yōu)勢。
在三種異種移植小鼠模型中對新載體進行驗證
以CEA為例，研究人員用PGK (phosphoglycerate kinase) 啟動子和人癌胚抗原CEA替換掉GFP，構(gòu)建了SP-nS/MARt-CEA，用電穿孔轉(zhuǎn)染構(gòu)建CAR-T細胞。與用慢病毒載體比較，新載體CAR表達水平更高，在腫瘤縮小、腫瘤生長延遲、延長生存期，腫瘤浸潤率等方面都更優(yōu)，但兩者都沒有徹底清除腫瘤，原因是出現(xiàn)腫瘤逃逸，腫瘤細胞抗原丟失。這在臨床治療中很常見。RCA方法檢測證實載體以質(zhì)粒形式存在，沒有整合到染色體上。處理40天后將轉(zhuǎn)染細胞與腫瘤細胞混合培養(yǎng)依然顯示強大的抗腫瘤活性。另外兩種腫瘤模型都顯示出新載體制備CAR-T細胞效果優(yōu)于，至少效果不輸給現(xiàn)有方法，而具有持久表達，遺傳風險小，制備簡單快捷這些優(yōu)勢就更不用說。
為什么選擇MaxCyte
實際上在作者建立和優(yōu)化實驗方案階段，測試了多個電轉(zhuǎn)平臺，但科學(xué)家們在最終建立的臨床規(guī)模CAR-T生產(chǎn)工藝中還是選擇了MaxCyte ExPERT GTx，主要是看中了MaxCyte電轉(zhuǎn)平臺真正用于細胞治療領(lǐng)域CAR-T臨床和商業(yè)化中的優(yōu)越性:（1）超高的轉(zhuǎn)染細胞數(shù)，單次轉(zhuǎn)染最高可達2e10 cells；（2）優(yōu)秀的擴展性，可從少量細胞快速擴展到臨床級別所需細胞量；（3）完全封閉的電轉(zhuǎn)流程；（4）操作簡單且易于整合進自動化操作流程中；（5）歐美大量細胞治療企業(yè)客戶選擇并驗證過的電轉(zhuǎn)平臺。
參考文獻：Bozza M, De Roia A, Correia M P, et al. A nonviral, nonintegrating DNA nanovector platform for the safe, rapid, and persistent manufacture of recombinant T cells[J]. Science advances, 2021, 7(16): eabf1333.
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