特定引物和探針在RPA檢測與塞內(nèi)卡谷病毒SVV快速檢測的應(yīng)用

畜牧業(yè)是我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要組成部分，對于基層養(yǎng)豬戶來說，由于受多種外在因素的影響，養(yǎng)豬場會出現(xiàn)多種豬類相關(guān)疾病。對于豬場養(yǎng)殖戶來說，豬仔患病，如果診斷治療不及時(shí)，有可能帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。常見豬類疫病如口蹄疫等多是由病毒引起，塞內(nèi)卡谷病毒（SVV）也是其中一種。
   
山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士研究生導(dǎo)師陳蕾教授課題組在《Analytical Biochemistry》新發(fā)表了題為Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of Seneca Valley Virus 的研究論文，探討研究了重組酶聚合酶擴(kuò)增 (RPA)快速檢測SVV的方法。
   
摘要內(nèi)容
塞內(nèi)卡谷病毒（SVV）的快速準(zhǔn)確檢測對于確定致病因素和啟動控制措施的實(shí)施至關(guān)重要。 開發(fā)可在樣品采集點(diǎn)使用的快速、簡單、方便和低成本的分子（核酸擴(kuò)增）測試方法已被確定為控制塞內(nèi)卡谷病毒（SVV）的關(guān)鍵要素。作者研究團(tuán)隊(duì)描述了針對 SVV 保守區(qū)域的重組酶聚合酶擴(kuò)增 (RPA) 測試的開發(fā)，以用于檢測 SVV。 研究人員設(shè)計(jì)的引物和探針在RPA檢測中表現(xiàn)出良好的敏感性和特異性，有助于RPA成為快速診斷SVV的有效工具。
 
背景介紹
2002年，美國研究人員偶然從PER.C6細(xì)胞（轉(zhuǎn)化的胎兒成視網(wǎng)膜細(xì)胞）培養(yǎng)基中首次發(fā)現(xiàn)并分離到一種新的病毒——塞內(nèi)卡谷病毒（Seneca Valley virus，SVV，又稱Seneca virus A，SVA）。塞內(nèi)卡谷病毒（Seneca Valley Virus，SVV）屬于小RNA病毒科塞內(nèi)卡谷病毒屬中的一員，臨床癥狀與其他水皰病臨床癥狀如口蹄疫類似，引起新生仔豬大量死亡和成年豬口部和蹄部出現(xiàn)水泡。
  自2002年確定以來，SVV主要在美國和加拿大零星散發(fā)，但自2014年年底后，SVV先后在多個國家大范圍流行。2015年傳入中國以后，SVV先后在福建、廣州、湖南、湖北、安徽、江蘇、浙江、河南、河北、遼寧、黑龍江等12個省份引發(fā)疫病。塞內(nèi)卡谷病毒（SVV）傳播特性與口蹄疫病毒類似，且與口蹄疫病毒存在混合感染，嚴(yán)重干擾了口蹄疫的防控。
 
目前多種分子技術(shù)手段已被用于檢測塞內(nèi)卡谷病毒（SVV），包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)、滾環(huán)擴(kuò)增 (RCA) 和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (LAMP) 等。 在現(xiàn)有的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中，重組酶聚合酶擴(kuò)增 (RPA) 可能是最適用于現(xiàn)場和即時(shí)診斷（point-of-need diagnosis）的方法。
RPA利用低溫孵育（37–42℃）進(jìn)行反應(yīng) ，只需最少的樣品制備，且擴(kuò)增時(shí)間短（約20分鐘），靈敏度高（每個反應(yīng)1-10 copies）。本研究介紹了SVV保守區(qū)引物和探針的設(shè)計(jì)，并評估了其在RPA實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)。
 
 
實(shí)驗(yàn)方法：
試驗(yàn)中用到的塞內(nèi)卡谷病毒（SVV）cDNA、口蹄疫病毒 (FMDV) cDNA、豬呼吸與生殖綜合征病毒 (PRRSV) cDNA、豬瘟病毒 (CSFV) cDNA、豬流行性腹瀉病毒 (PEDV) cDNA、傳染性胃腸炎冠狀病毒 (TGEV) cDNA和陰性豬cDNA均由山東省疾病預(yù)防控制中心提供。本研究中使用的病毒樣本均在陰性豬cDNA 中稀釋到一定濃度。經(jīng)基因工程技術(shù)把靶標(biāo)基因克隆裝載到特定載體中，得到重組質(zhì)粒 pET-32a SVV，重組質(zhì)粒濃度為300 ng/μL。類似實(shí)驗(yàn)操作的得到其它病毒質(zhì)粒 (pET-32a-FDMV, pET-32a-PRRSV, pET- 32a-CSFV, pET-32a-PEDV, pET-32a-TGEV)。
之后設(shè)計(jì)并合成特定引物及探針，進(jìn)行重組酶聚合酶擴(kuò)增 (RPA) 測試，實(shí)驗(yàn)反應(yīng)在等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測儀（H1600，柏恒科技）上進(jìn)行，在 42°C 溫度條件下開始擴(kuò)增，反應(yīng)約20分鐘。產(chǎn)生高于陰性對照閾值的指數(shù)擴(kuò)增曲線的樣品被認(rèn)為是陽性的。后續(xù)研究團(tuán)隊(duì)對RPA進(jìn)行了特異性、敏感性及重復(fù)性的分析，結(jié)果均顯示良好。
 
結(jié)論：
該研究描述了RPA法檢測SVV的特異性引物和探針，具有良好的靈敏度和特異性，快至8分鐘即可產(chǎn)生陽性結(jié)果，一般不超過20分鐘。 塞內(nèi)卡谷病毒（SVV）RPA檢測是在柏恒科技的等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測儀H1600上進(jìn)行的，儀器體積小，重量輕，方便攜帶。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，特異性引物和探針有助于RPA技術(shù)成為SVV快速檢測的良好候選技術(shù)。它可以檢測患病動物，以便及時(shí)治療和控制感染傳播。 實(shí)驗(yàn)中用到的等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測儀H1600為柏恒科技生產(chǎn)，儀器檢測快速，體積小，可用于便攜式操作，適用牧場、林場、動物疫病檢測等多場景。 此外柏恒還提供動物疫病檢測解決方案，我們提供包括離心機(jī)、金屬浴、PCR儀等全流程實(shí)驗(yàn)儀器，更多內(nèi)容，歡迎咨詢聯(lián)系。
 
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