Biomed. Opt. Express：OCTA表征早期皮膚輻射損傷

皮膚輻射損傷（CRI）是由暴露于高劑量電離輻射（IR）引起的皮膚損傷。由于最初的臨床潛伏期和隨后的炎癥爆發(fā)，導(dǎo)致CRI的診斷和治療較為困難。因此臨床癥狀出現(xiàn)前早期檢測(cè)CRI將有助于有效治療。韓國(guó)研究人員JUNGBIN LEE等證明光學(xué)相干斷層掃描血管造影術(shù)（OCTA）可以非侵入性地檢測(cè)CRI小鼠模型潛伏期內(nèi)的皮膚變化。通過(guò)暴露于各種紅外劑量在小鼠后肢誘導(dǎo)CRI，通過(guò)OCTA縱向成像損傷的皮膚區(qū)域直到臨床癥狀出現(xiàn)。觀察發(fā)現(xiàn)OCTA檢測(cè)到皮膚的一些變化，包括皮膚增厚、大血管擴(kuò)張和血管邊緣不規(guī)則。組織學(xué)研究也證實(shí)了OCTA的發(fā)現(xiàn)。表明OCTA可用于早期CRI檢測(cè)。研究成果以“Characterization of early-stage cutaneousradiation injury by using optical coherence tomography angiography”為題發(fā)表于Biomedical Optics Express。

  背景

 皮膚輻射損傷（CRI）是暴露于高劑量電離輻射（IR）引起的對(duì)皮膚和下層組織的損傷，包括對(duì)基底角質(zhì)細(xì)胞和毛囊干細(xì)胞等連續(xù)分裂細(xì)胞的直接損傷，以及隨后的炎癥。臨床中CRI有一個(gè)特征，即照射后臨床癥狀延遲發(fā)作，其中的無(wú)癥狀期被稱為潛伏期。CRI癥狀在潛伏期后變得明顯，根據(jù)嚴(yán)重程度出現(xiàn)紅斑、水腫、色素變化、干燥和潮濕脫屑、潰瘍和壞死等癥狀。除傳統(tǒng)的保守治療外，目前暫無(wú)有效的預(yù)防措施或治療方法。這種連續(xù)且不可預(yù)測(cè)的炎癥爆發(fā)可導(dǎo)致臨床癥狀診斷和治療滯后。CRI的早期處理有利于減少損傷區(qū)的擴(kuò)大，提高治療效果。因此對(duì)CRI的非侵入性早期診斷似乎是非常重要的。

 光學(xué)成像方法允許對(duì)皮膚的局部變化進(jìn)行非侵入性和敏感的檢測(cè)，并且已經(jīng)有各種光學(xué)技術(shù)測(cè)試用于早期CRI檢測(cè)。3D光學(xué)顯微如反射共聚焦顯微鏡（RCM）和雙光子顯微鏡（TPM）顯示出的潛力可通過(guò)觀察潛伏期的細(xì)胞變化來(lái)進(jìn)行早期檢測(cè)。有研究在急性放射性皮炎出現(xiàn)臨床癥狀之前，使用RCM檢測(cè)到皮膚真皮中的海綿樣增生、胞吐和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。此外使用RCM和TPM在CRI小鼠模型的臨床潛伏期都檢測(cè)到表皮細(xì)胞和皮脂腺的損傷。雖然顯微技術(shù)的檢測(cè)靈敏度很高，但視野（FOV）相對(duì)較小，實(shí)際情況中的篩查范圍可能受到限制。受損皮膚中負(fù)責(zé)氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和其他分子向組織的運(yùn)輸和交換的微循環(huán)也會(huì)受到CRI影響。高光譜成像（hyperspectral imaging, HIS）和散射光譜法（diffuse optical spectroscopy）可在臨床潛伏期檢測(cè)到脈管系統(tǒng)的灌注和氧合的變化。激光多普勒血流計(jì)可測(cè)量由CRI引起的血液灌注變化。這些方法測(cè)量了與CRI相關(guān)的脈管系統(tǒng)的功能變化。而光學(xué)成像方法通過(guò)血管可視化，能夠評(píng)估血管的形態(tài)變化。光學(xué)相干斷層掃描血管造影術(shù)（OCTA）可以基于光反射實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)地觀察皮膚的微觀結(jié)構(gòu)和脈管系統(tǒng)，已經(jīng)在各種皮膚病學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。有研究利用OCTA發(fā)現(xiàn)皮膚厚度和血管密度增加是對(duì)紫外線輻射的急性反應(yīng)。OCTA在患有銀屑病、慢性移植物抗宿主病和硬皮病等病理狀況的參與者中觀察到了毛細(xì)血管水平的血管和結(jié)構(gòu)變化。使用OCTA進(jìn)行過(guò)的CRI研究包括檢測(cè)全身γ射線照射后早期，小鼠耳廓脈管系統(tǒng)的退化和再生。

 本項(xiàng)研究使用OCTA在局部照射小鼠模型的CRI早期階段觀察皮膚的結(jié)構(gòu)和血管變化。在小鼠后肢上以不同劑量照射：0 Gy（對(duì)照）、10 Gy、20 Gy和40 Gy，并通過(guò)OCTA縱向成像照射的皮膚區(qū)域，直到出現(xiàn)臨床癥狀。與明場(chǎng)成像和組織學(xué)結(jié)果比較，對(duì)皮膚的變化進(jìn)行了定性和定量分析。

 結(jié)果
 01-CRI小鼠后肢皮膚的縱向明場(chǎng)成像
 

用明視野成像技術(shù)縱向觀察CRI無(wú)毛小鼠模型的輻照皮膚區(qū)域，在照射后每?jī)商炫臄z一次縱向明場(chǎng)圖像（圖1）�？梢�(jiàn)0Gy（對(duì)照）小鼠顯示出正常無(wú)毛小鼠皮膚的典型特征：皮膚蒼白，毛發(fā)分布稀疏。而在受照射小鼠從照射后第4天開(kāi)始出現(xiàn)一些變化。在10Gy組小鼠中，照射后第4天觀察到脫毛，然后沒(méi)有進(jìn)一步的進(jìn)展。在20 Gy和40 Gy組小鼠中，照射后第4天觀察到脫毛，然后第8天觀察到紅斑和脫皮。40 Gy組小鼠的臨床癥狀比20Gy組小鼠更嚴(yán)重。研究認(rèn)為20Gy和40 Gy組小鼠模型的臨床潛伏期為照射后6天，因?yàn)榕R床癥狀出現(xiàn)在第8天�；�于明場(chǎng)成像的結(jié)果對(duì)照射后前8天進(jìn)行縱向OCTA成像研究。



 

 

圖1 CRI小鼠后肢皮膚的縱向明場(chǎng)成像圖。圖像下方黑色水平箭頭線表示臨床診斷及損傷進(jìn)展。照射后第8天的紅框圖像表明臨床可見(jiàn)的CRI階段。

  02-高劑量CRI小鼠潛伏期晚期皮膚的典型OCTA圖像

 CRI小鼠皮膚的縱向明場(chǎng)圖像顯示，20 Gy和40 Gy小鼠的潛伏期均為照射后6天，因此對(duì)整個(gè)潛伏期進(jìn)行縱向OCTA成像（圖2）。正面OCTA圖像為MIP圖像，OCTA圖像分別為50-125 μm（真皮淺層）和100-325 μm（真皮深層）不同深度范圍內(nèi)產(chǎn)生�？梢�(jiàn)在0 Gy（對(duì)照）小鼠中，明場(chǎng)圖像和OCT圖像都顯示正常的皮膚結(jié)構(gòu)：明場(chǎng)圖像顯示皮膚蒼白，毛發(fā)稀疏；截面OCT圖像顯示表層高散射的薄薄真皮，及真皮下弱散射的筋膜或肌肉層。真皮中觀察到毛囊和皮脂腺等顯微結(jié)構(gòu)。兩張正面OCTA圖像分別顯示了皮膚真皮淺層和深層的毛細(xì)血管/小血管以及相對(duì)較大的血管，其中大血管邊緣平滑。在40 Gy組小鼠中，照射后第6天的皮膚明場(chǎng)圖像除顯示脫毛外，沒(méi)有太多可見(jiàn)的變化。然而OCTA檢測(cè)到皮膚有幾處變化。截面OCT圖像顯示，照射后第6天的皮膚較對(duì)照組相比，真皮增厚，反射強(qiáng)度降低。由于皮膚真皮增厚，肌肉和筋膜層出現(xiàn)的深度比對(duì)照組更深。正面OCTA圖像顯示與對(duì)照組相比，輻射組真皮淺層的小血管變化不大，但真皮深層的大血管變化顯著。大血管擴(kuò)張，血管邊緣不規(guī)則。不規(guī)則的血管邊緣可能為內(nèi)皮細(xì)胞損傷引起的滲漏。此外還有更多的小而扭曲的血管分支。40 Gy小鼠潛伏期晚期的OCTA圖像顯示，潛伏期內(nèi)皮膚存在由CRI引起的結(jié)構(gòu)和血管改變。

 

 

圖2 對(duì)照（a-d）和40 Gy輻射（e-h）組小鼠皮膚在潛伏期晚期（照射后第6天）的明場(chǎng)圖像和OCTA圖像。分別為明場(chǎng)圖像、截面OCT圖像、正面OCTA MIP圖像。真皮淺層和深層的OCTA圖像分別用紅色和黑白描繪。截面OCT圖像（b，f）右側(cè)的黑色箭頭線標(biāo)記皮膚表皮和真皮的平均厚度，紅色箭頭標(biāo)記真皮底部。40 Gy深層真皮正面OCTA MIP圖像（h）中綠色箭頭為不規(guī)則血管邊界。

 03-臨床潛伏期皮膚厚度的縱向變化

 在潛伏期間，通過(guò)縱向OCTA成像詳細(xì)分析了CRI小鼠皮膚的變化（圖3）。可見(jiàn)在0 Gy（對(duì)照）組小鼠皮膚中，OCT圖像清楚地顯示正常皮膚結(jié)構(gòu)，包括表層高度散射的真皮及下面弱散射的筋膜或肌肉層。由于對(duì)當(dāng)前OCT系統(tǒng)的圖像分辨率來(lái)說(shuō)，小鼠皮膚的表皮太薄，因此OCT圖像中沒(méi)有識(shí)別最上面的表皮。而在受照射組小鼠皮膚中，10 Gy組小鼠皮膚厚度仍與對(duì)照組皮膚厚度大致相同，其余組縱向OCT圖像顯示皮膚真皮增厚。真皮和肌肉層之間的界限清晰可見(jiàn)。


 

圖3 臨床潛伏期CRI小鼠皮膚的縱向截面OCT描圖像。（a-d）分別為0 Gy（對(duì)照）、10 Gy、20 Gy和40 Gy組。紅色箭頭標(biāo)記皮膚真皮底部。比例尺橫向（x）1mm，軸向（z）400μm。

 

在20 Gy和40 Gy小鼠皮膚中，隨著皮膚厚度隨時(shí)間增加，真皮中的反射強(qiáng)度逐漸降低，而真皮和肌肉層之間的邊界也隨之變得不那么清晰。但在潛伏期仍然可能找到邊界。在觀察期間對(duì)皮膚增厚進(jìn)行定量分析（圖4）�？梢�(jiàn)在0Gy（對(duì)照）組小鼠中，成像期間皮膚厚度恒定；10Gy組小鼠皮膚厚度與0 Gy小鼠相似，保持不變；然而20 Gy和40 Gy組小鼠中都觀察到皮膚厚度逐漸增加，照射后第4天的皮膚厚度明顯高于同時(shí)期的對(duì)照組小鼠皮膚。照射后第6天，20 Gy和40 Gy小鼠的皮膚厚度分別約為0Gy小鼠皮膚厚度的1.49倍和1.62倍。皮膚增厚的原因尚不清楚，可能是由于血管損傷和滲漏。但分析結(jié)果表明OCTA可檢測(cè)潛伏期CRI的進(jìn)展情況。



 

 

圖4 截面強(qiáng)度OCT圖像中的皮膚增厚度定量分析。不同顏色分別代表0Gy（黑色）、10Gy（綠色）、20Gy（藍(lán)色）和40Gy（紅色）的皮膚厚度。由0 Gy組的平均厚度標(biāo)準(zhǔn)化，統(tǒng)計(jì)顯著性：*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01，***p ≤ 0.001，***p ≤ 0.0001。

 
 

04-潛伏期晚期CRI小鼠皮膚的組織學(xué)研究
 為證實(shí)OCTA檢測(cè)到的結(jié)構(gòu)變化，對(duì)CRI小鼠模型的后肢皮膚進(jìn)行H&E染色（圖5）�？梢�(jiàn)0 Gy（對(duì)照）小鼠皮膚的組織學(xué)圖像顯示正常的皮膚結(jié)構(gòu)：薄的表皮和真皮，真皮中規(guī)則分布的毛囊和皮脂腺以及下面的肌肉。10 Gy小鼠皮膚的組織學(xué)圖像也顯示正常皮膚結(jié)構(gòu)，類似于0 Gy（對(duì)照）組。20 Gy和40 Gy組小鼠皮膚的組織學(xué)圖像顯示了幾種變化：表皮和真皮均增厚；表皮細(xì)胞和皮脂腺及毛囊中的細(xì)胞簇受損；真皮內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。隨著照射劑量增加，這些變化更加嚴(yán)重。這些組織學(xué)圖像顯示了CRI的細(xì)胞變化細(xì)節(jié)，并證實(shí)了OCTA觀察到的皮膚增厚。



 

 

圖5 潛伏期晚期（照射后第6天）CRI小鼠皮膚的組織學(xué)圖像。黑色箭頭標(biāo)記出薄表皮和正常皮脂腺。黃色箭頭標(biāo)記增厚的表皮和部分或完全受損的毛囊和皮脂腺。帶箭頭的黑色虛線表示表皮和真皮的深度范圍。

 

05-潛伏期皮膚脈管系統(tǒng)的縱向變化
 

OCTA在潛伏期后期檢測(cè)到的CRI小鼠皮膚的另一個(gè)特征是深層真皮中的大血管變化，因此利用縱向OCTA成像技術(shù)對(duì)潛伏期大血管的變化進(jìn)行了詳細(xì)監(jiān)測(cè)（圖6）。正面OCTA MIP圖像從距離皮膚表面100-325 μm深度范圍手動(dòng)根據(jù)厚度調(diào)整生成。0 Gy（對(duì)照）組小鼠皮膚的OCTA圖像顯示了真皮深層的典型脈管系統(tǒng)。大血管直徑約100μm，血管直徑隨著分支而減小。血管在邊緣筆直光滑。在10Gy組小鼠皮膚中，OCTA圖像顯示與0 Gy（對(duì)照）小鼠皮膚中相似的血管形態(tài)。雖然照射后第5天血管分支略有增加，但大血管的直徑和形狀保持不變。在20 Gy和40 Gy組小鼠皮膚中，OCTA圖像檢測(cè)到大血管隨時(shí)間推移發(fā)生的變化：血管擴(kuò)張，血管邊緣變得不規(guī)則。隨時(shí)間推移小而扭曲的血管分支越來(lái)越多。在20 Gy組小鼠皮膚中，照射后第2天大血管表現(xiàn)正常。隨后第3天血管出現(xiàn)擴(kuò)張和邊界不規(guī)則并持續(xù)發(fā)展。在40Gy組小鼠皮膚中，大血管相對(duì)較薄，并在照射后第2天局部擴(kuò)張，第3天出現(xiàn)更多扭曲的血管，然后在潛伏期晚期出現(xiàn)局部擴(kuò)張和邊界不規(guī)則性。



 

 

圖6 潛伏期CRI小鼠真皮深層大血管的縱向正面OCTA MIP圖像。圖中相同顏色箭頭代表同一個(gè)血管。比例尺1mm。

 

通過(guò)分析縱向OCTA圖像來(lái)量化40 Gy組小鼠皮膚中大血管的直徑和邊界不規(guī)則性變化（圖7）。圖7a-b和c-d分別為照射后第2天和第6天0 Gy和40 Gy組小鼠皮膚的代表性O(shè)CTA圖像，放大圖像顯示用于分析的大血管。在這兩天，0 Gy小鼠皮膚圖像中的血管看起來(lái)都是直的，邊界清晰。另一方面40 Gy組小鼠血管在照射后第2天相對(duì)比較直，在第6天變大且不規(guī)則。圖7e和f為潛伏期期間血管直徑和邊界不規(guī)則性的分析結(jié)果。40 Gy組小鼠中，照射后第6天皮膚中大血管的平均直徑為照射后第2天的1.43 ± 0.05倍。在0 Gy小鼠皮膚中，代表血管邊界不規(guī)則性的變異系數(shù)約為0.14。40 Gy組小鼠皮膚中血管邊界變異系數(shù)隨時(shí)間增加，與0 Gy小鼠皮膚相比，照射后第6天明顯升高（0.23）。分析結(jié)果表明，40 Gy組小鼠皮膚在潛伏期內(nèi)大血管的直徑和邊界不規(guī)則性均發(fā)生顯著變化，并且OCTA可以檢測(cè)到血管的變化。

 

 

圖7 潛伏期不同時(shí)間點(diǎn)0 Gy和40 Gy組小鼠大血管的OCTA圖像以及血管變化的定量分析。作圖分別為照射后第2天和第6天0 Gy組（a，b）和40 Gy組（c，d）小鼠中的大血管OCTA圖像。在這兩天檢測(cè)到的相同血管用綠色虛線框標(biāo)出。（e）輻照后第6天大血管相對(duì)于第2天的相對(duì)直徑。（f）血管邊緣不規(guī)則。統(tǒng)計(jì)顯著性：**p ≤ 0.01，***p ≤ 0.001，****p ≤ 0.0001。

結(jié)論
 

本研究使用OCTA描述CRI小鼠最初潛伏期皮膚的結(jié)構(gòu)和血管的變化。用不同劑量進(jìn)行局部照射并進(jìn)行縱向OCTA成像。觀察到在潛伏期，20 Gy和40 Gy高劑量輻射暴露使小鼠模型的皮膚發(fā)生了一些變化，如皮膚增厚、大血管擴(kuò)張和血管邊緣不規(guī)則。而10Gy低輻射劑量暴露的皮膚中沒(méi)有觀察到這種變化。定量分析發(fā)現(xiàn)在20 Gy和40 Gy小鼠皮膚中，從輻照后第4天開(kāi)始皮膚增厚變得顯著，照射后第6天的皮膚分別比對(duì)照組小鼠厚約1.49倍和1.62倍。在照射后第2-4天局部觀察到大血管的擴(kuò)張和不規(guī)則的血管邊界，然后擴(kuò)散到更多的大血管。組織學(xué)研究也證明了皮膚增厚。展現(xiàn)出OCTA在檢測(cè)結(jié)構(gòu)和血管變化方面的優(yōu)勢(shì)，即高成像速度和可深入皮膚真皮的高成像深度。

 雖然本研究存在一定局限性，如目前研究發(fā)現(xiàn)的特征可能不適用于人類受試者。但測(cè)得的真皮衰減數(shù)據(jù)可以作為早期CRI檢測(cè)的一個(gè)特征。此外，OCTA的成像速度還可以提高，利用OCTA檢測(cè)CRI皮膚中功能性的微結(jié)構(gòu)和脈管系統(tǒng)變化，如氧飽和度、氧血紅蛋白和脫氧血紅蛋白濃度等。結(jié)合OCTA成像和光譜成像方法的多模態(tài)成像可用于將脈管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能變化相關(guān)聯(lián)，以實(shí)現(xiàn)精確和早期檢測(cè)CRI 。

 總之，作為一種潛在的早期檢測(cè)方法，OCTA在出現(xiàn)臨床癥狀之前，在暴露于高劑量輻射的小鼠皮膚中檢測(cè)到皮膚增厚和大血管的變化。對(duì)這些變化進(jìn)行定性和定量分析，并用明場(chǎng)成像和組織學(xué)進(jìn)行了驗(yàn)證。表明OCTA對(duì)CRI的早期變化敏感，可作為一種良好的早期檢測(cè)方法。

 

 

參考文獻(xiàn)：Lee, J. , et al. "Characterization of early-stage cutaneous radiation injury by using angiographic optical coherence tomography." Biomedical Optics Express 11.5(2020).