定量OCTA揭示清醒與麻醉小鼠腦皮層的血管和血流差異

大多數(shù)體內(nèi)神經(jīng)血管成像研究都是在麻醉動(dòng)物中進(jìn)行的，但麻醉對(duì)腦血液動(dòng)力學(xué)有很大影響。因此華盛頓大學(xué)研究人員Adiya Rakymzhan等應(yīng)用光學(xué)微血管造影（OMAG）和多普勒光學(xué)微血管造影（DOMAG），定量評(píng)估了麻醉對(duì)小鼠腦血管系統(tǒng)和腦血流量的影響。OMAG結(jié)果顯示麻醉劑ketamine-xylazine和異氟醚（isoflurane）會(huì)引起大血管直徑和毛細(xì)血管密度增加，表明兩種麻醉劑會(huì)都引起血管舒張。此外DOMAG的初步結(jié)果顯示異氟醚會(huì)使基線腦血流量增加。證明通過OCT血管造影方法，能夠測量清醒與麻醉小鼠間大血管和毛細(xì)腦血管網(wǎng)絡(luò)基線形態(tài)學(xué)和血流參數(shù)的差異。文章以“Differences in cerebral blood vasculature and flow in awake andanesthetized mouse cortex revealed by quantitative optical coherence tomographyangiography”為題發(fā)表于Journal of Neuroscience Methods。


  背景
 使用活體動(dòng)物模型成像腦血流（CBF）對(duì)于理解CBF調(diào)節(jié)和腦功能的機(jī)制來講意義非凡。由于在圖像采集過程中，要避免因運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的偽影，因此大部分光學(xué)成像研究都是在麻醉動(dòng)物中進(jìn)行。然而不同的麻醉劑會(huì)破壞基線（刺激前的靜息）血液動(dòng)力學(xué)和對(duì)刺激的功能性反應(yīng)，可能導(dǎo)致對(duì)血液動(dòng)力學(xué)反應(yīng)和腦血管疾病研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)不同解釋。如使用α-氯醛糖（α-chloralose）或?yàn)趵�坦（urethane）麻醉時(shí)，腦血管對(duì)乙醇的反應(yīng)為血管收縮，而氟烷（halothane）麻醉時(shí)乙醇誘導(dǎo)血管舒張。因此非常有必要研究麻醉對(duì)動(dòng)物模型基線腦血液動(dòng)力學(xué)的影響。此外有研究表明，上游動(dòng)脈和皮質(zhì)內(nèi)微血管可能具有單獨(dú)或獨(dú)立的機(jī)制來調(diào)節(jié)局部CBF，表明有必要從大血管和微循環(huán)（毛細(xì)血管）兩者水平上研究血管反應(yīng)。

 有研究報(bào)告了麻醉動(dòng)物和清醒動(dòng)物對(duì)功能性刺激的血液動(dòng)力學(xué)反應(yīng)的差異。小鼠視覺皮層的光學(xué)成像結(jié)果顯示，與麻醉期情況下相比，清醒時(shí)神經(jīng)活動(dòng)后的血液動(dòng)力學(xué)反應(yīng)更強(qiáng)、更快。對(duì)大鼠的功能磁共振成像（fMRI）研究表明，烏拉坦麻醉后，胡須刺激引發(fā)的血液動(dòng)力學(xué)反應(yīng)的時(shí)間分布與清醒狀態(tài)不同。使用正電子發(fā)射斷層掃描（PET）對(duì)狒狒的研究中發(fā)現(xiàn)，由于ketamine麻醉對(duì)枕葉的影響，靜息CBF增加，但受限于空間分辨率，沒有探索血管形態(tài)變化。雙光子成像量化了異氟醚（isoflurane）麻醉對(duì)狨猴腦微血管的舒張作用，并顯示基線血流速度降低。然而受限于視野（FOV），僅在單個(gè)血管層面進(jìn)行了分析。有研究使定量光聲顯微鏡評(píng)估了異氟醚麻醉下，小鼠腦的基線血液動(dòng)力學(xué)和氧代謝的變化，但研究集中于大血管，并不包括毛細(xì)血管反應(yīng)評(píng)估。鑒于基礎(chǔ)血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)定量信息的缺乏，以及當(dāng)前成像模式的技術(shù)限制，需要對(duì)宏觀和微血管水平的麻醉效果進(jìn)行更詳細(xì)的分析。

 本文使用光學(xué)相干斷層掃描（OCT）探究了麻醉劑對(duì)基線狀態(tài)血管尺寸和CBF參數(shù)的影響。光學(xué)顯微血管造影術(shù)（OMAG）是OCT的一個(gè)高級(jí)擴(kuò)展，其優(yōu)勢在于可以幾乎不受背景組織噪聲影響地提取血流信號(hào)，基于此發(fā)展出了另一種OCT血管造影方法，即Doppler OMAG（DOMAG）。DOMAG可檢測穿透血管中的軸向血流速度，這會(huì)揭示關(guān)于腦血流的詳細(xì)信息。OMAG和DOMAG技術(shù)的結(jié)合已廣泛用于各種腦血管研究，包括卒中、動(dòng)脈新生和衰老。本研究的主要目的是證明該OCT雙圖像處理方法能夠補(bǔ)充且更全面地分析麻醉對(duì)腦血管形態(tài)和血流的影響。

 本研究應(yīng)用OMAG和DOMAG相結(jié)合的方法比較麻醉和清醒狀態(tài)下，小鼠皮層的血管和血流參數(shù)。通過測量動(dòng)/靜脈直徑、毛細(xì)血管面積密度、毛細(xì)血管流量、軸向流速和總血流量的變化，系統(tǒng)評(píng)價(jià)異氟醚和ketamine-賽拉嗪對(duì)腦血管張力和血液動(dòng)力學(xué)的影響。
 

 

圖1 OCT系統(tǒng)示意圖。

 

結(jié)果
 01-麻醉對(duì)血管舒張的影響
 

OMAG揭示了異氟醚和ketamine-賽拉嗪（K-X）誘導(dǎo)的血管擴(kuò)張（圖2）。為使比較更準(zhǔn)確，根據(jù)分支順序?qū)�靜脈和動(dòng)脈分支進(jìn)行分類：1段（Seg1）為最近端，2段（Seg2）在中間，3段（Seg3）為最遠(yuǎn)端（圖2A）。圖2B和C分別為OCT獲得的皮層結(jié)構(gòu)和血流橫截面圖像。從圖2C黃色和藍(lán)色線間約50μm厚的組織數(shù)據(jù)獲得OMAG血管造影圖像。圖2D-F的血管造影圖對(duì)應(yīng)異氟醚麻醉、K-X麻醉和清醒狀態(tài)。從圖2G-I二元掩模（binary masks）圖像中測量Seg 1（紅色）、2（綠色）和3（紫色）的靜脈和動(dòng)脈直徑值。比較三種不同方案中每個(gè)靜脈和動(dòng)脈段的ΔD（圖2K-L）。總的來說，從清醒到異氟醚麻醉狀態(tài)呈增加趨勢。K-X麻醉組靜脈Seg 3的ΔD比清醒組高11 %（p = 0.0498）。異氟醚組靜脈Seg 2的ΔD比K-X組高6%（p = 0.0430），比清醒組高22%（p = 0.0198）。異氟醚組動(dòng)脈Seg 1的ΔD比K-X組高12 %（p = 0.0352），比清醒組高29%（p = 0.0104）。這些結(jié)果表明，與清醒狀態(tài)相比，麻醉狀態(tài)下的靜脈和動(dòng)脈直徑增加，意味著異氟醚和K-X會(huì)引起顯著的血管擴(kuò)張。

 

 

圖2動(dòng)靜脈段直徑的比較。（A）血管分支的分類。（B）B-scan結(jié)構(gòu)截面圖像。（C）B-scan血流截面圖像。黃線表示皮質(zhì)表面，藍(lán)線和綠線分別位于距皮質(zhì)表面50μm和300μm深度。（D-F）不同狀態(tài)下OMAG血管造影照片，從3D OMAG數(shù)據(jù)集的正面MIP獲得，位于圖C黃色和藍(lán)色虛線之間。（G-I）分別對(duì)應(yīng)D-F血管造影的血管掩膜圖像，用紫色（Seg3）、綠色（Seg2）和紅色（Seg1）表示血管直徑大小。（K-L）三種狀態(tài)下Seg 3、Seg 2和Seg 1靜脈和動(dòng)脈直徑變化指數(shù)的比較。
 

 

02-毛細(xì)血管的血管面積密度和流量
 

比較三種不同狀態(tài)下的毛細(xì)血管的VAD（vessel area density）和流量，處理OMAG血管造影（圖3A–C）結(jié)果，排除大動(dòng)脈和大靜脈（圖3D–F）。生成其余毛細(xì)血管在異氟醚、K-X麻醉和清醒狀態(tài)下的毛細(xì)血管VAD圖（圖3G-I）和流量圖（圖3K-M）。圖3N顯示了三種不同狀態(tài)下的流量指數(shù)分布符合核分布（Kernel distribution），其中觀察到異氟醚組的流量指數(shù)最大，超過平均值，而清醒組的流量指數(shù)最小。圖3O-P分別給出了三種條件下給定區(qū)域的平均VAD和平均CFI（capillary flux index）的比較。結(jié)果顯示，清醒組的平均VAD比K-X組低23%（p = 0.0368），比異氟醚組低25%（p = 0.0065）。清醒組的平均CFI比K-X組低5%（p = 0.0369），比異氟醚組低15%（p = 0.0131）�？偟膩碚f，從清醒到麻醉狀態(tài)，毛細(xì)血管VAD和平均CFI都增加了。
 

 

圖3毛細(xì)血管中VAD和流量的比較。（A-C）三種狀態(tài)下的OMAG血管造影，彩條代表信號(hào)強(qiáng)度高低。（D-F）不包括動(dòng)脈和靜脈的OMAG血管造影。（G-I）三種狀態(tài)下的毛細(xì)管VAD圖。彩條代表局部白色像素比例，其中藍(lán)色較小，紅色較大。（K-M）三種狀態(tài)下的CFI圖。顏色條表示從0到1的強(qiáng)度信號(hào)。（N）三種狀態(tài)下的毛細(xì)血管通量直方圖分布符合核分布。（O）三種狀態(tài)下的平均VAD比較。（P）三種狀態(tài)下的平均CFI比較。

 

03-穿透血管的腦血流測量
 

為評(píng)估清醒狀態(tài)和麻醉狀態(tài)之間的腦血流差異，量化了一只動(dòng)物的紅細(xì)胞軸向速度、血流橫截面積和總血流（圖4）。圖4A和B顯示了異氟醚麻醉和清醒狀態(tài)下的雙向正面DOMAG軸向速度圖譜。分別以綠色和紅色顯示下潛的小動(dòng)脈和上行的小靜脈，以6.0mm/s范圍的彩色條編碼表示軸向流速信息。從圖4C 3D數(shù)據(jù)提取矩形切片（圖4D-E），以比較清醒組和異氟醚組間四個(gè)區(qū)域的平均軸向速度（圖4F）、流動(dòng)橫截面積（圖4G）和總血流（圖4H）。從清醒到異氟醚麻醉狀態(tài)，平均流速值僅增加3%，而血流橫截面積值增加57%（p < 0.04），總血流量增加55%（p < 0.04）。此外從圖4A，B，D和E發(fā)現(xiàn)，從清醒狀態(tài)到異氟醚麻醉狀態(tài)，穿透血管密度增加，這支持了圖3G-1中毛細(xì)血管VAD結(jié)果。

 

 

圖4一只種動(dòng)物腦血流參數(shù)的比較。（A-B）異氟醚和清醒狀態(tài)下小鼠皮層的雙向軸向腦血流速度圖。顏色條表示紅細(xì)胞在6.0mm/s范圍內(nèi)向下（負(fù)，綠色）和向上（正，紅色）移動(dòng)的軸向速度。黃色是投影效果產(chǎn)生的綠色和紅色信號(hào)的混合。（C）從3D DOMAG數(shù)據(jù)集生成的300μm厚組織的3D可視化圖像，帶有上升和下潛的血管。（D-E）C中皮質(zhì)表面以下約50mm x-y平面上的矩形切片。綠點(diǎn)和紅點(diǎn)代表血管流動(dòng)橫截面。（F-H）平均軸向速度、血流橫截面積和總血流量的比較。

 

結(jié)論

 

本研究使用OMAG和DOMAG技術(shù)，從大血管和毛細(xì)血管水平定量比較了清醒與麻醉狀態(tài)下的腦血管舒張和血流情況。發(fā)現(xiàn)麻醉劑會(huì)使血管直徑增加，異氟醚增加最大，ketamine-賽拉嗪程度較輕，進(jìn)一步支持麻醉引起大血管擴(kuò)張。

 本研究中的OMAG技術(shù)也證明可在毛細(xì)血管水平上顯示血管灌注和擴(kuò)張?jiān)黾印�VAD描述了整體毛細(xì)血管灌注，也反映了血管大小的變化，給出了關(guān)于毛細(xì)血管擴(kuò)張的信息。從清醒狀態(tài)到麻醉狀態(tài)，平均VAD增加（圖3O），表明毛細(xì)血管灌注和毛細(xì)血管擴(kuò)張?jiān)黾�。此外，從清醒狀態(tài)到麻醉狀態(tài)，平均CFI增加（圖3P），意味著麻醉也提高了毛細(xì)血管流量。

 已知大腦血管擴(kuò)張導(dǎo)致動(dòng)脈壓降低，隨后會(huì)引起CBF升高和外周血灌注。在一只動(dòng)物身上進(jìn)行的對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然紅細(xì)胞的平均軸向速度從清醒狀態(tài)到異氟醚狀態(tài)沒有顯著變化（圖4F），但流動(dòng)橫截面積增加了57 %（圖4G）�？傃�流量也增加了55 %（圖4H）。與已有的結(jié)論一致，即異氟醚和ketamine會(huì)使基線CBF增加。

 此外盡管成像技術(shù)發(fā)展迅速，但向完全清醒成像仍有一定難度，動(dòng)物產(chǎn)生的壓力和不適會(huì)影響獲得的信號(hào)。已知麻醉劑的作用是劑量依賴性的，低異氟醚濃度（1.3%-1.5%）可保持CBF值與清醒狀態(tài)接近。因此可以在不同條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并將獲得的結(jié)果進(jìn)行比較，以產(chǎn)生可靠的結(jié)果。

 總之，本研究使用OMAG和DOMAG技術(shù)，測量并比較了清醒與麻醉小鼠大腦血管和毛細(xì)血管網(wǎng)的基線形態(tài)學(xué)和血流參數(shù)。結(jié)果顯示異氟醚和ketamine-賽拉嗪會(huì)引起大血管和毛細(xì)血管舒張。血管尺寸的增加導(dǎo)致CBF增加。證明了OCT雙圖像處理方法可以補(bǔ)充并全面分析麻醉對(duì)腦血管和血流的影響。

  參考文獻(xiàn)：Rakymzhan, A. , et al. "Differences in cerebral blood vasculature and flow in awake and anesthetized mouse cortex revealed by quantitative optical coherence tomography angiography." Journal of Neuroscience Methods 353.2(2021):109094.