如何處理實時熒光定量PCR的數(shù)據(jù)詳解

實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)中的基本概念：

在整個擴增過程中會出現(xiàn)基線期，指數(shù)期，線性期和平臺期。其中在基線期和指數(shù)增長期，擴增產(chǎn)物都是以指數(shù)級增長，但是在基線期我們沒辦法檢測；而到了線性期和平臺期之后，由于不同基因，或者不同條件下其擴增效率差別很大，因此沒有辦法計算模板的含量。因此，在指數(shù)增長期的CT值就成了計算模板含量的關(guān)鍵值。

▲ 圖一：線性圖譜
 

▲ 圖二：對數(shù)圖譜
 

為什么知道CT值就能夠得到最初的目標(biāo)基因含量呢？

如圖三，表示一個基因單次擴增曲線。N為擴增產(chǎn)物的分子數(shù)，模板的分子數(shù)乘以1+擴增效率的n次方，n代表循環(huán)次數(shù)。也就是說，如果擴增效率為100%，產(chǎn)物的分子數(shù)就等于模板數(shù)乘以2的n次方。但是在線性增長期和平臺期，擴增效率不可能是100%，因此PCR理論方程只在指數(shù)期成立，也就是圖三綠色框的部分。

▲ 圖三
 

數(shù)據(jù)處理：

以下三張圖分別表示我們在做熒光定量PCR時提到的三個名稱：擴增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線、溶解曲線。

1、絕對定量：使用一系列稀釋的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與未知樣本同時進行測定，根據(jù)系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品的CT值與起始模板量之間的線性比例關(guān)系。

注意事項：

☑  標(biāo)準(zhǔn)品必須來源可靠，濃度已知。

☑  標(biāo)準(zhǔn)品要和待測樣品同時在儀器中擴增。

☑  只能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品覆蓋的濃度范圍進行待測樣本濃度的推測。

2、相對定量：是用來確定經(jīng)過不同處理的樣品之間的表達差異或目標(biāo)在不同時相差的表達差異，也就是倍數(shù)差異。

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