高通量技術加速抗猴痘病毒化合物篩選

猴痘是一種病毒性人畜共患病，是由于感染猴痘病毒 (Monkeypox virus) 而致，近期猴痘病毒在非洲及以外多個國家出現(xiàn)，且數(shù)量還在增加，并出現(xiàn)了人際傳播，備受科學家關注。
 

猴痘病毒屬于痘病毒科—脊椎動物痘病毒亞科下的一個屬，被稱為正痘病毒屬。正痘病毒屬包括多種不同類別的病毒，我們比較熟知的天花病毒就是其中一種。

 

正痘病毒屬內(nèi)的所有病毒都可產(chǎn)生交叉免疫反應，這意味著一種病毒感染時產(chǎn)生的細胞毒性 T 淋巴細胞和產(chǎn)生抗體的 B 淋巴細胞可以防止該屬其他病毒的感染，這也是天花疫苗可以對猴痘病毒產(chǎn)生 85% 保護力的原因。
 
   

正痘病毒是一種雙鏈 DNA 病毒，個頭較大，結(jié)構相對復雜。病毒最外面被外膜包圍，呈磚形，病毒粒子內(nèi)部有一個啞鈴型的核心，主要成分是病毒的基因組雙鏈 DNA，以及多種 (至少 20 種以上) 病毒增殖相關的酶。病毒核心由一層膜包圍，啞鈴核心與外膜之間的區(qū)域稱為側(cè)體 (lareral body)。

 

正痘病毒有兩種感染模式：成熟病毒粒子 (mature virion，MV) 有單一的脂膜包裹著一個啞鈴狀的核心，是一種基本的感染形態(tài)，此外，痘病毒還有一種形態(tài)，也就是成熟病毒粒子外還包圍有一層額外的脂質(zhì)膜 (extracellular enveloped，EV)。兩種病毒粒子內(nèi)部結(jié)構相同，但由于包膜表面內(nèi)嵌有不同的表面蛋白，因此侵入機制略有不同。

 

圖 1 . 痘病毒結(jié)構示意圖^[1]

   
病毒感染機制大概模式基本類似，即附著于宿主細胞表面——進入宿主細胞 (通過內(nèi)吞、膜融合或二者同時) ——脫殼 (即病毒基因組釋放) ——病毒基因組復制——病毒蛋白合成、加工及組裝——新組裝病毒釋放。
痘病毒的 2 種感染機制，下面做一下詳細講解

圖 2. 痘病毒復制周期^[3]

 

■ 1. 附著、入胞

前面講過正痘病毒有兩種病毒粒子：成熟病毒粒子 (MV) 和包膜病毒粒子 (EV)。由于EV 相比 MV 外面多一層膜，所以附著機制也有一定區(qū)別。

 

對于成熟病毒粒子 MV，通過病毒表面膜蛋白與宿主細胞表面蛋白結(jié)合而附著于宿主細胞表面。而包膜病毒粒子 EV，最外層包膜上面的蛋白與細胞結(jié)合后，可以導致最外層包膜降解，成為和 MV 一樣的結(jié)構，然后通過與 MV 一樣的機制附著于細胞表面。

 

病毒附著于細胞后，病毒包膜與細胞膜融合，在細胞膜上形式成一個孔，含病毒 dsDNA 的核心通過這個孔進入到細胞中。

 

■ 2. 脫殼

病毒粒子核心進入宿主細胞后，通過微管深入到細胞核外的一個離散位置，將病毒基因組釋放出來，并在這里建立 “病毒工廠”，進行病毒基因組的復制，轉(zhuǎn)錄及組裝。

 

■ 3. 轉(zhuǎn)錄、翻譯

 

正痘病毒不需要進入細胞核進行復制，因為啟動轉(zhuǎn)錄和處理病毒 mRNA 所需的所有酶都隨病毒粒子核心攜帶進入細胞中 (自理能力很強)。由于正痘病毒的 DNA 復制發(fā)生在基因早期轉(zhuǎn)錄和翻譯之后，所以我們先簡單說下轉(zhuǎn)錄翻譯: 正痘病毒的轉(zhuǎn)錄是以級聯(lián)的方式進行，即早期轉(zhuǎn)錄翻譯所編碼的蛋白用于 DNA 復制及中期基因組轉(zhuǎn)錄，而中期轉(zhuǎn)錄翻譯所編碼的蛋白可以用于后期基因表達。

 

正痘病毒的一個很大特點就是會編碼大量蛋白，一些蛋白通過中和干擾素和細胞因子、抑制凋亡和干擾細胞抗病毒信號通路等方式參與多種免疫逃逸反應。并且這些蛋白會包裝在新的病毒粒子里面，在感染過程中被運送至其他細胞中。

 

■ 4. DNA 復制

正痘病毒 DNA 復制也是一個很有意思的地方。前面講過，痘病毒 DNA 的復制是在細胞質(zhì)中進行的，和其他很多病毒不一樣。正痘病毒在早期基因轉(zhuǎn)錄和翻譯后立即開始 DNA復制。具體過程見下圖：

 

圖 3. 正痘病毒復制過程^[2]

 

■ 5. 病毒組裝、成熟和釋放

病毒工廠，首先形成月牙膜，并招募基因組DNA和核心蛋白，形成球形的未成熟病毒粒子。在側(cè)體相關的病毒蛋白酶作用下，病毒粒子成熟，在細胞裂解時被釋放出來，即 MV 形成。

當 MV 通過高爾基復合體或胞內(nèi)體時，形成了被雙層膜包圍的MV即wrapped virion，wrapped virion通過胞吐作用被釋放出細胞時，最外層膜與細胞膜融合，形成含單層膜包圍的 MV，即 EV。EV 主要與細胞間擴散有關，而 MV 主要是與宿主的感染有關。

 

 

 

目前還沒有專門針對猴痘病毒的藥物。前面提到，由于正痘病毒之間可以產(chǎn)生交叉免疫反應，所以天花疫苗可以對猴痘病毒產(chǎn)生保護力。JYNNEO^TM (Imvanex) 疫苗已經(jīng)在美國批準用于猴痘預防。但還沒有用于猴痘治療的小分子藥物，但根據(jù)體外及動物實驗數(shù)據(jù)表明，Cidofovir、Brincidofovir (CMX001) 及 Tecovirimat (ST-246) 對正痘病毒具有較好的活性，美國 CDC 表示，以上藥物可以用于預防猴痘的爆發(fā)。

 

同時基于其他抗病毒藥物的開發(fā)經(jīng)驗，可以通過干擾病毒生命周期的關鍵調(diào)控蛋白達到抑制病毒增殖的目的，進行藥物開發(fā)。

 

■ 現(xiàn)有抗病毒藥物

抗病毒藥物比較常用的靶點包括病毒膜表面蛋白、宿主細胞受體、調(diào)控膜融合的關鍵蛋白、DNA 復制關鍵酶 (如 DNA 聚合酶、蛋白合成關鍵酶，如 RNA 聚合酶，及病毒粒子包裝釋放相關蛋白等)。因為不同病毒生命周期中關鍵調(diào)控蛋白不同，具體靶點還需要對該病毒具體感染機制進行深入研究。

 

但部分靶點在不同病毒之間可以通用，比如 DNA 聚合酶，RNA 聚合酶等。所以靶向這類靶點的抗病毒藥物會具有一定廣譜性。如上述 Cidofovir 通過抑制病毒 DNA 聚合酶活性以控制巨細胞病毒 CMV 復制，該藥物對多種正痘病毒也有較高的抑制活性。此外核苷類化合物，可以模擬機體內(nèi)核苷及核苷酸，參與 DNA 或 RNA 合成，阻斷核酸復制，是常見的廣譜抗病毒藥物。

 

白色: 表示痘苗病毒復制的主要階段。黃色: 干擾復制的每一步的代表性化合物。

細胞外包膜病毒粒子(EEV)，細胞內(nèi)成熟病毒粒子(IMV)，不成熟病毒粒子(IV)，細胞內(nèi)包膜病毒粒子(IEV)和細胞相關包膜病毒粒子(CEV)。

 
 

■ 高通量篩選可用于抗病毒藥物開發(fā)

上面已經(jīng)說到，部分靶點在病毒之間可以通用，此外不同的病毒感染機制不完全一樣，但感染的模式基本相同。從已經(jīng)報道具有抗病毒活性的化合物或藥物中篩選抗正痘病毒藥物，會大大提高篩選命中率，加快藥物開發(fā)的速度。尤其針對發(fā)生率不高，市場潛力不大但需求迫切的抗病毒藥物來說，從現(xiàn)有的抗病毒藥物中開發(fā)新適應癥，開發(fā)成本低，研發(fā)速度快，是一種不錯的的解決方案。

 

高通量篩選技術一直是早期藥物開發(fā)的重要重要篩選方式。MCE 可以提供 100+不同的化合物庫，涵蓋 15000+活性化合物，是先導化合物開發(fā)的重要來源。相關抗病毒化合物庫推薦：

 

相關抗病毒化合物庫推薦

抗病毒化合物庫 650+ 種抗病毒化合物集合，對多種病毒有效，是開發(fā)抗病毒藥物的有效工具。

核苷類化合物庫 包含 260+ 種核苷酸類化合物，包括核苷酸、核苷及其結(jié)構類似物，是開發(fā)抗病毒藥物的有效工具。

抗 COVID-19 化合物庫 基于多種 COVID-19 病毒關鍵靶點，利用虛擬篩選技術， 對 MCE 已有的老藥新用化合物庫進行虛擬篩選，匯總整理出 1500+ 種具有潛在抗新型冠狀病毒活性的化合物，是篩選抗新型冠狀病毒藥物的有力工具。

抗丙型肝炎病毒化合物庫 200+ 種具有明確及潛在抗 HCV 活性的化合物，是開發(fā)新的抗 HCV 藥物及抗感染研究的有用工具。

抗正痘病毒活性化合物推薦

Cidofovir Cidofovir 可通過抑制病毒 DNA 聚合酶活性以控制巨細胞病毒 CMV 復制。對多種正痘病毒有活性。

Brincidofovir Brincidofovir (CMX001) 是 Cidofovir 的脂質(zhì)結(jié)合前體藥物，是一種口服、長效抗病毒藥物。Brincidofovir 對廣泛的 DNA 病毒具有活性，包括巨細胞病毒 (CMV)、腺病毒 (ADV)、水痘帶狀皰疹病毒、單純皰疹病毒、多瘤病毒、乳頭瘤病毒、痘病毒和混合雙鏈 DNA 病毒感染。

‍Mitoxantrone Mitoxantrone 是拓撲異構酶 II (topoisomerase II) 的抑制劑；也可抑制蛋白激酶 C (PKC)，IC50 值為8.5 μM。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務。

 

 

 

參考文獻

1.  Jennifer Louten, Chapter 15 - Poxviruses, Editor(s): Jennifer Louten, Essential Human Virology, Academic Press, 2016, Pages 273-290, ISBN 9780128009475

2.  Moss B. Poxvirus DNA replication. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013 Sep 1;5(9):a010199.

3.  McFadden G. Poxvirus tropism. Nat Rev Microbiol. 2005 Mar;3(3):201-13.

4.  Prichard MN, Kern ER. Orthopoxvirus targets for the development of antiviral therapies. Curr Drug Targets Infect Disord. 2005 Mar;5(1):17-28.