qPCR實(shí)驗(yàn)中安全科學(xué)地取材操作詳解

規(guī)劃一個(gè)qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，最先碰到的問(wèn)題就是研究目的和材料的選擇。要想做好一個(gè)qPCR實(shí)驗(yàn)首先要根據(jù)目的選好材料。
 

以目標(biāo)為導(dǎo)向的取材

研究目標(biāo)的設(shè)立是非常重要的一個(gè)起始環(huán)節(jié)，所以對(duì)于樣本取材要求做到兩點(diǎn)，具體準(zhǔn)確性和具體代表性。
 

空間異質(zhì)性

個(gè)體的生物變異程度（也可以解讀為生物多樣性）往往是比較高的，這也正是以群體細(xì)胞為研究對(duì)象的數(shù)據(jù)往往遭受質(zhì)疑，而單細(xì)胞水平的研究正開(kāi)展得如火如荼的原因。
 

如何使取到的樣本更具代表性？

首先，提前做好功課，了解樣本的不同分型，或者了解詳細(xì)的細(xì)胞分群。如果條件允許盡可能覆蓋所有的組織類型或者細(xì)胞類型。
 

其次，盡可能增加樣本數(shù)量，也就是生物學(xué)重復(fù)，從而更客觀地反映生物變異程度。一般建議生物學(xué)重復(fù)的數(shù)量至少是10。
 

時(shí)間異質(zhì)性

生物個(gè)體的活動(dòng)會(huì)受到生物節(jié)律的調(diào)控，細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平也同樣如此。由于轉(zhuǎn)錄的時(shí)間異質(zhì)性，很多時(shí)候會(huì)導(dǎo)致qPCR的假陰性結(jié)果，如果采樣時(shí)間不合適，會(huì)導(dǎo)致基因有表達(dá)或者表達(dá)量很低的錯(cuò)誤結(jié)論。因此采樣時(shí)首先要確認(rèn)采樣時(shí)間是否會(huì)對(duì)最后的結(jié)果造成影響，建議做一個(gè)比較全面的時(shí)間節(jié)點(diǎn)研究。

樣本數(shù)量

前面建議增加生物學(xué)重復(fù)，但有時(shí)候超過(guò)10個(gè)的樣本數(shù)量并不能保證最后能得到有顯著表達(dá)量差異的結(jié)果（假如表達(dá)有顯著差異是真實(shí)存在的），不到10個(gè)的樣本數(shù)量在表達(dá)量差異很大的情況下也是足夠的，這涉及到統(tǒng)計(jì)中的power calculation，很多網(wǎng)站提供在線計(jì)算，如http://www.univie.ac.at/ medstat等。Power calculation需要提供被比較的兩個(gè)組表達(dá)量比值、標(biāo)準(zhǔn)差和設(shè)定的α和β水平，這樣就可以計(jì)算出所需要的最少的樣本數(shù)量。表達(dá)量比值和標(biāo)準(zhǔn)差等信息往往不能提前預(yù)知，需要查閱之前相似實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，或者通過(guò)小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)來(lái)獲得粗略的信息。一般也可通過(guò)估算來(lái)得到所需的樣本數(shù)量，提供一定的參考意義。
 

* power一定的情況檢測(cè)不同表達(dá)量差異所需的最少樣本數(shù)量[3].
 

采樣是需要嚴(yán)格規(guī)劃的過(guò)程，比如材料的時(shí)效性、珍貴程度等，都要納入考量范圍。本文討論的幾個(gè)因素對(duì)qPCR結(jié)果的影響是更直接的，需要倍加關(guān)注。
 

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