PCR擴增在幽門螺桿菌耐藥性分析的應用
幽門螺桿菌知多少
幽門螺桿菌是一種螺旋形、微厭氧、對生長條件要求十分苛刻的革蘭氏陰性細菌，1983年首次從慢性活動性胃炎患者的胃黏膜活檢組織中分離成功。世界上有約一半的人感染了幽門螺桿菌，但很多沒有臨床癥狀。幽門螺桿菌及其患病率在某些人群中高達80％。幽門螺桿菌可能通過接觸感染者的唾液、嘔吐物或糞便傳播，食用受污染的食物或水也會感染。大多數感染幽門螺桿菌的人都是在兒童時期感染的。
幽門螺桿菌感染可導致慢性胃炎、消化性潰瘍病（PUD）、胃癌和胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤等胃腸道疾病。它還可能與非消化系統(tǒng)疾病有關，如口臭、身材矮小、營養(yǎng)不良和兒童難治性缺鐵性貧血。根除幽門螺桿菌有助于治療慢性胃炎、PUD 和其他相關疾病，并降低患胃癌的風險。
近期，重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院消化科主任李中躍老師課題組在歐洲兒科醫(yī)學期刊《European Journal of Pediatrics》上發(fā)表Antibiotic resistance of Helicobacter pylori isolated from children in Chongqing, China的研究論文，研究團隊對重慶地區(qū)兒童幽門螺桿菌耐藥性進行了分析。
研究背景
幽門螺桿菌 (H. pylori) 感染是人類最常見的慢性細菌感染之一，作為幽門螺桿菌的一線治療方案，標準的三聯(lián)療法包括一種質子泵抑制劑(PPI) 和兩種抗生素：克拉霉素和阿莫西林（如果對青霉素過敏，可以用甲硝唑代替阿莫西林）。首次引入該療法時，它達到了很高的根除率（> 90%）。然而，近年來該方案在世界許多地區(qū)的療效一直在下降，根除率<80%，不再適合臨床實踐。根除率低的原因可能涉及不適當的治療、患者依從性差、吸煙、CYP2C19 基因多態(tài)性和胃中的高細菌負荷。幽門螺桿菌對抗生素的耐藥性通常被認為是根除失敗的主要原因。突變在幽門螺桿菌的抗生素耐藥性中起重要作用。作為最常用的大環(huán)內酯類藥物之一，克拉霉素通過可逆地與細菌23S rRNA分子50S核糖體亞基的結構域V的肽基轉移酶環(huán)結合，抑制蛋白質合成。據報道，23S rRNA 基因域 V 中的點突變與克拉霉素耐藥性相關。A2142G 和 A2143G 的點突變（transtions）是最普遍的突變。氟喹諾酮類藥物通過抑制 DNA 促旋酶的活性來干擾細菌中 DNA 的合成。幽門螺桿菌對氟喹諾酮類藥物的抗性與 gyrA 基因喹諾酮類藥物抗性決定區(qū)的點突變有關。
實驗方法
幽門螺桿菌菌株分離：重慶醫(yī)科大學兒童醫(yī)院消化內科門診對156例疑似幽門螺桿菌感染患兒進行胃活檢，在調查前的最后2個月內，所有兒童均未服用任何H2受體拮抗劑、PPI、鉍和抗生素。通過上消化道內鏡在胃竇處采集胃黏膜活檢標本，樣本經處理培養(yǎng)后，對疑似透明菌落通過革蘭氏染色和脲酶、過氧化氫酶、氧化酶活性試驗鑒定，然后確定幽門螺桿菌。
抗生素藥敏試驗：采用瓊脂稀釋法檢測幽門螺桿菌菌株對六種抗生素（克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林、四環(huán)素和呋喃唑酮）的耐藥性。將幽門螺桿菌懸浮液接種到含有5% 羊血和臨界濃度的單一抗生素的培養(yǎng)板上，然后在微需氧條件下在37°C 下孵育 3 至 5 天。抗生素折點（breakpoints）為克拉霉素≥1.0 μg/mL、甲硝唑≥8.0 μg/mL、左氧氟沙星≥2.0 μg/mL、阿莫西林≥2.0 μg/mL、四環(huán)素≥2.0 μg/mL、呋喃唑酮≥2.0 μg/mL。試驗中ACTC11637用作對照菌株。
23S rRNA 和 gyrA 基因的突變分析：
提取分離菌株的DNA，設計引物用于擴增23S rRNA 和 gyrA 基因。使用 BIO-GENER PCR 擴增儀進行PCR擴增，最后對PCR 產物進行鑒定，并進行 Sanger 測序以檢測 23S rRNA 中 2143、2142 位、gyrA 基因中 87 和 91 位密碼子的突變。
統(tǒng)計學分析：數據采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行分析。不同性別、年齡組和內鏡檢查結果的耐藥發(fā)生率采用卡方檢驗（χ2 檢驗），概率（p）值≤0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。
其中，基因擴增實驗中用到的PCR擴增儀來自柏恒科技。
結果
研究顯示，共分離出112株（71.8%）幽門螺桿菌。有56名男孩和56名女孩，所有兒童的平均年齡為9.6±3.0歲，范圍為3.0至17.9歲。112例患者中，最常見的癥狀是腹痛（77.7%），內鏡下主要表現為幽門螺桿菌相關性胃炎（86.6%），僅有15例患者出現十二指腸潰瘍。在 112 個樣本中，102 個菌株檢測到 23S rRNA 和 gyrA 基因的突變。A2143G突變率為48.0%（49/102）；沒有發(fā)現任何 A2142G 突變。gyrA基因突變率為16.7%（17/102），在17株菌株中，對應Asn87和Asp91的突變率分別為9.8%（10/102）和6.9%（7/102）。研究人員還發(fā)現11株同時具有23S rRNA和gyrA基因突變。沒有觀察到 Asn87 和 Asp91 突變之間的 MIC (最低抑菌濃度)值有顯著差異(p>0.05)。
討論
許多國家都報道了兒童對克拉霉素的耐藥性，其患病率從 16.0% 到 50.9% 不等。在該研究中，克拉霉素的耐藥率為47.3%，高于中國其他地區(qū)以往報道（16.4-31.8%），但低于北京（84.9-96.6%）。歐洲的一項多中心研究分析了門診社區(qū)中抗生素使用與抗生素耐藥性之間的關系，以治療幽門螺桿菌感染，并表明長效大環(huán)內酯類藥物的使用與幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥性相關。在大環(huán)內酯類中也觀察到強烈的交叉耐藥性。因此，中國幽門螺桿菌感染兒童對克拉霉素的高耐藥性可能歸因于大環(huán)內酯類藥物在呼吸系統(tǒng)和其他疾病中的頻繁使用。 在臨床實踐中調節(jié)和限制大環(huán)內酯類的給藥可能有利于降低高耐藥性。
重慶市幽門螺旋桿菌感染兒童對克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星耐藥率較高。大多數克拉霉素耐藥菌株均檢測到A2143G突變，而gyrA突變點的Asn87和Asp91在左氧氟沙星耐藥菌株中常見。在臨床實踐中，抗幽門螺桿菌治療應根據藥敏試驗個體化。
在今天的介紹中，我們了解了關于幽門螺桿菌耐藥一些情況及背后分子層面機理，對于我們預防和治療幽門螺桿菌提供了不少信息。分子層面研究可以用到的PCR儀簡介如下，歡迎咨詢了解更多。
PCR儀
RePure系列智能二維梯度PCR儀
本系列PCR儀具有二維梯度摸索功能，多種梯度摸索模式；
自適應壓桿式熱蓋，合蓋緊蓋一步到位；
前進后出式風道，機器可并排放置，節(jié)約實驗空間；
Q3200系列熒光定量PCR儀
本系列熒光PCR儀采用四通道雙16孔模塊設計，可實現一機多用；
最大升降溫速率8℃/s，大大節(jié)約實驗時間；
體積小，重量輕，方便攜帶；
幽門螺桿菌是一種螺旋形、微厭氧、對生長條件要求十分苛刻的革蘭氏陰性細菌，1983年首次從慢性活動性胃炎患者的胃黏膜活檢組織中分離成功。世界上有約一半的人感染了幽門螺桿菌，但很多沒有臨床癥狀。幽門螺桿菌及其患病率在某些人群中高達80％。幽門螺桿菌可能通過接觸感染者的唾液、嘔吐物或糞便傳播，食用受污染的食物或水也會感染。大多數感染幽門螺桿菌的人都是在兒童時期感染的。
幽門螺桿菌感染可導致慢性胃炎、消化性潰瘍病（PUD）、胃癌和胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤等胃腸道疾病。它還可能與非消化系統(tǒng)疾病有關，如口臭、身材矮小、營養(yǎng)不良和兒童難治性缺鐵性貧血。根除幽門螺桿菌有助于治療慢性胃炎、PUD 和其他相關疾病，并降低患胃癌的風險。
研究背景
幽門螺桿菌 (H. pylori) 感染是人類最常見的慢性細菌感染之一，作為幽門螺桿菌的一線治療方案，標準的三聯(lián)療法包括一種質子泵抑制劑(PPI) 和兩種抗生素：克拉霉素和阿莫西林（如果對青霉素過敏，可以用甲硝唑代替阿莫西林）。首次引入該療法時，它達到了很高的根除率（> 90%）。然而，近年來該方案在世界許多地區(qū)的療效一直在下降，根除率<80%，不再適合臨床實踐。根除率低的原因可能涉及不適當的治療、患者依從性差、吸煙、CYP2C19 基因多態(tài)性和胃中的高細菌負荷。幽門螺桿菌對抗生素的耐藥性通常被認為是根除失敗的主要原因。突變在幽門螺桿菌的抗生素耐藥性中起重要作用。作為最常用的大環(huán)內酯類藥物之一，克拉霉素通過可逆地與細菌23S rRNA分子50S核糖體亞基的結構域V的肽基轉移酶環(huán)結合，抑制蛋白質合成。據報道，23S rRNA 基因域 V 中的點突變與克拉霉素耐藥性相關。A2142G 和 A2143G 的點突變（transtions）是最普遍的突變。氟喹諾酮類藥物通過抑制 DNA 促旋酶的活性來干擾細菌中 DNA 的合成。幽門螺桿菌對氟喹諾酮類藥物的抗性與 gyrA 基因喹諾酮類藥物抗性決定區(qū)的點突變有關。
實驗方法
幽門螺桿菌菌株分離：重慶醫(yī)科大學兒童醫(yī)院消化內科門診對156例疑似幽門螺桿菌感染患兒進行胃活檢，在調查前的最后2個月內，所有兒童均未服用任何H2受體拮抗劑、PPI、鉍和抗生素。通過上消化道內鏡在胃竇處采集胃黏膜活檢標本，樣本經處理培養(yǎng)后，對疑似透明菌落通過革蘭氏染色和脲酶、過氧化氫酶、氧化酶活性試驗鑒定，然后確定幽門螺桿菌。
抗生素藥敏試驗：采用瓊脂稀釋法檢測幽門螺桿菌菌株對六種抗生素（克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林、四環(huán)素和呋喃唑酮）的耐藥性。將幽門螺桿菌懸浮液接種到含有5% 羊血和臨界濃度的單一抗生素的培養(yǎng)板上，然后在微需氧條件下在37°C 下孵育 3 至 5 天。抗生素折點（breakpoints）為克拉霉素≥1.0 μg/mL、甲硝唑≥8.0 μg/mL、左氧氟沙星≥2.0 μg/mL、阿莫西林≥2.0 μg/mL、四環(huán)素≥2.0 μg/mL、呋喃唑酮≥2.0 μg/mL。試驗中ACTC11637用作對照菌株。
23S rRNA 和 gyrA 基因的突變分析：
提取分離菌株的DNA，設計引物用于擴增23S rRNA 和 gyrA 基因。使用 BIO-GENER PCR 擴增儀進行PCR擴增，最后對PCR 產物進行鑒定，并進行 Sanger 測序以檢測 23S rRNA 中 2143、2142 位、gyrA 基因中 87 和 91 位密碼子的突變。
統(tǒng)計學分析：數據采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行分析。不同性別、年齡組和內鏡檢查結果的耐藥發(fā)生率采用卡方檢驗（χ2 檢驗），概率（p）值≤0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。
其中，基因擴增實驗中用到的PCR擴增儀來自柏恒科技。
結果
研究顯示，共分離出112株（71.8%）幽門螺桿菌。有56名男孩和56名女孩，所有兒童的平均年齡為9.6±3.0歲，范圍為3.0至17.9歲。112例患者中，最常見的癥狀是腹痛（77.7%），內鏡下主要表現為幽門螺桿菌相關性胃炎（86.6%），僅有15例患者出現十二指腸潰瘍。在 112 個樣本中，102 個菌株檢測到 23S rRNA 和 gyrA 基因的突變。A2143G突變率為48.0%（49/102）；沒有發(fā)現任何 A2142G 突變。gyrA基因突變率為16.7%（17/102），在17株菌株中，對應Asn87和Asp91的突變率分別為9.8%（10/102）和6.9%（7/102）。研究人員還發(fā)現11株同時具有23S rRNA和gyrA基因突變。沒有觀察到 Asn87 和 Asp91 突變之間的 MIC (最低抑菌濃度)值有顯著差異(p>0.05)。
討論
許多國家都報道了兒童對克拉霉素的耐藥性，其患病率從 16.0% 到 50.9% 不等。在該研究中，克拉霉素的耐藥率為47.3%，高于中國其他地區(qū)以往報道（16.4-31.8%），但低于北京（84.9-96.6%）。歐洲的一項多中心研究分析了門診社區(qū)中抗生素使用與抗生素耐藥性之間的關系，以治療幽門螺桿菌感染，并表明長效大環(huán)內酯類藥物的使用與幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥性相關。在大環(huán)內酯類中也觀察到強烈的交叉耐藥性。因此，中國幽門螺桿菌感染兒童對克拉霉素的高耐藥性可能歸因于大環(huán)內酯類藥物在呼吸系統(tǒng)和其他疾病中的頻繁使用。 在臨床實踐中調節(jié)和限制大環(huán)內酯類的給藥可能有利于降低高耐藥性。
重慶市幽門螺旋桿菌感染兒童對克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星耐藥率較高。大多數克拉霉素耐藥菌株均檢測到A2143G突變，而gyrA突變點的Asn87和Asp91在左氧氟沙星耐藥菌株中常見。在臨床實踐中，抗幽門螺桿菌治療應根據藥敏試驗個體化。
在今天的介紹中，我們了解了關于幽門螺桿菌耐藥一些情況及背后分子層面機理，對于我們預防和治療幽門螺桿菌提供了不少信息。分子層面研究可以用到的PCR儀簡介如下，歡迎咨詢了解更多。
PCR儀
本系列PCR儀具有二維梯度摸索功能，多種梯度摸索模式；
自適應壓桿式熱蓋，合蓋緊蓋一步到位；
前進后出式風道，機器可并排放置，節(jié)約實驗空間；
本系列熒光PCR儀采用四通道雙16孔模塊設計，可實現一機多用；
最大升降溫速率8℃/s，大大節(jié)約實驗時間；
體積小，重量輕，方便攜帶；
